氯霉素全抗原的合成及鉴定

为建立氯霉素的免疫分析方法,采用混合酸酐法和重氮化法,将半抗原氨霉素(CAP)与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原CAP-BSA和包被抗原CAP-OVA.以紫外扫描确定偶联率,并用酶联免疫(ELISA)的方法鉴定,确定偶联成功.经过比较,混合酸酐法优于重氮化法.     

内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达

根据绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422菌株内切葡聚糖酶基因egⅡ的cDNA序列,设计特异引物,以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1 194bp的egⅡ成熟肽cDNA片段.将该片段分别克隆到大肠杆菌(Escherichia coil)表达载体pET-28a( )和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌Rosset(DE3)和毕赤酵母GS115中进行了表达.重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性.重组毕赤酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2 788U/ml.酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,pH 3.5～6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上.     

木聚糖酶Xyn Ⅱ的D37N突变、表达及酶学性质变化

对来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的木聚糖酶Xyn Ⅱ进行同源建模和序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了Xyn Ⅱ的D37N定点突变.酵母表达的Xyn ⅡD37N 经纯化后与原酶Xyn Ⅱ(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,Xyn ⅡD37N 的最适pH由4.2升高到5.3,pH稳定范围由3.0～7.5缩减为3.0～5.5,但最适温度和热稳定性基本保持不变.结果证实,木聚糖酶Xyn Ⅱ的第37位Asp与最适pH相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础.     

大肠杆菌表达GST-Aβ_(42)融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的:为了提高β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ_(42))基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法:大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果:SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论:GST-Aβ_(42)基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶

建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶茵株的平板方法。该方法以华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA’平板-Fast blue RR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛茵株接种至含有2％甲醇的BMMYA’平板上,30℃生长并诱导4～5d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顸层琼脂。2min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90％。     

人血清白蛋白在乳酸克鲁维酵母中的表达

以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis,K.lactis)GG799为宿主对人血清白蛋白(HSA)进行分泌表达。以pPIC9k-HSA为模板,采用带有XhoⅠ和NotⅠ酶切位点的引物PCR扩增获得HSA基因,经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后插入pKLAC1,构建表达载体pKLAC1-HSA。经SalⅡ线性化后,电击转化K.lactis GG799,用含5 mmol/L乙酰胺的YCB平板筛选阳性转化子。提取基因组DNA,采用PCR方法对转化子鉴定后进行摇瓶发酵。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析发酵上清液中的表达产物,并初步分析酵母基础N源(YNB)对HSA在K.lactis GG799中表达的影响。结果表明,HSA成功在K.lactis GG799中分泌表达,表达量为81μg/mL,遗传稳定性好。     

甾体生物转化技术研究的现状与进展

从半合成原料、菌种选育及改良和生物转化新技术与新工艺(包括底物的物理/化学助溶法,新型转化体系和细胞通透性改良法)等方面对近几年来甾体生物转化进展进行综述。可以预测,在甾体药物的工业化生产过程中,生物转化技术所占比例将大幅度提高。     

真空微波诱变结合化学诱变选育酸性纤维素酶高产菌株

以酸性纤维素酶产生菌绿色木霉（Trichoderma viride）WL0512作为原始出发菌株,首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的菌株TVN-18,其羧甲基纤维素酶活（CMC酶活）达2765．8U／g,滤纸酶活（FPA酶活）达48．5U／g。再经真空微波和甲基磺酸乙酯（EMS）逐级诱变处理,获得了一株高产、稳产酸性纤维素酶的E6—1菌株,其CMC酶活达4396．6U／g,FPA酶活达126．0U／g,分别是菌株TVN-18的1．59倍和2．60倍。通过对固态发酵培养基麸皮和稻草比例、料水比以及初始pH值的优化,突变株的产酶能力进一步得到提高,其产的CIVIC酶活和FPA酶活分别提高了22．3％和22．4％。     

霞水母糖蛋白抗疲劳作用的实验研究

本文对霞水母糖蛋白的抗疲劳作用进行了研究。试验中分别以50、100、200mg／kg剂量的霞水母糖蛋白经口给予小鼠连续灌胃30d,然后分别进行小鼠负重游泳试验、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸测定。结果显示,霞水母糖蛋白各剂量组小鼠的游泳时间明显长于对照组（P〈0．01）;各剂量组小鼠运动后血清尿素氮含量低于对照组（P〈0．05或P〈0．01）;中、高剂量组小鼠肝糖原含量均明显高于对照组（P〈0．01）;各剂量组小鼠运动后的血乳酸含量均小于对照组（P〈0．01）。从而表明,霞水母糖蛋白具有抗疲劳作用。     

PTH融合蛋白研究进展

甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone)是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素,是人体内维持血钙恒定的主要激素.PTH在人体内的生理功能非常广泛,PTH类似物已被开发成为治疗骨质疏松症的一系列新型药物.为了克服人PTH分子量小、在人体内代谢快、临床应用不方便的缺点,长效融合蛋白体的研究逐渐成为一种趋势,并且取得了一定的成就.主要依据国内外对PTH重组体和PTH融合蛋白体的研究现状,对PTH的构效关系与生理活性、PTH类似物的研究成果及PTH的应用前景进行综述.