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Four human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 cDNA fragments containing extracellular domain loops 2, 1-2, 2-3 and 1-3 respectively were amplified from human placen-tal cDNA library by PCR and used for screening ligand binding domains by yeast two-hybrid system. The result showed that, not only loop 1-3, but also the smaller fragment loop 2-3 could bind to hVEGF165. Recombinant expression plasmids pPIC9K/Flt-1(1-3) and pPIC9K/Flt-1 (2-3) were constructed and transformed to Pichia. pastoris host strain GS115, cultured in flasks, and expressed under the induction of 1 % methanol. The expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecules and contained more than 60% of total protein after being induced for 4d. After being purified by CM-Sepharose FF and Sephacryl S-100 chromatography, its purity reached above 90%. Biological assay in vitro showed that the binding capacity of expressed soluble Flt-1 (2-3) to hVEGF165 and its inhibiting effect on the proliferation of human um 相似文献
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TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR(P55)的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR(P55)胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明:该蛋白具有TNFR(P55)特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。 相似文献
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人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的?… 总被引:2,自引:0,他引:2
将编码血管内皮细胞生长因子受体FIt-1胞外区1-3loop316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/FIt=1(1-3),转化酵母景菌GS115,筛选His^+Mut^s表型转化子,经插瓶培养,1%甲醇诱导表达4d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中FIt-1(1-3)表达这总蛋白的30-% 相似文献
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血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓?… 总被引:1,自引:0,他引:1
朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3)。将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcD-NA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选 相似文献
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可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。 相似文献
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将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。 相似文献
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应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2A/CMV/hGM-CSF.经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗性克隆。经PCR和Southemblot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10 ̄4CFU/ml,克隆细胞培养上清用TF-1细胞可检测到GM-CSF活性。 相似文献
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将hGM-CSFcDNA插入含有P11k及25k双向启动子的痘苗病毒载体PJ120的P11K启动子下游,而P25K下游则为LacZ基因,成表达质粒pJ120/GM-CSF。,以此质粒与痘苗病毒天坛株共转染TK-143细胞。在BUdisplay status 相似文献
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粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
基因工程重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症.在正确克隆人G-CSFcDNA的基础上,重点对G-CSFcDNA的5′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入pBV220载体组建成功pBV220/G-CSF/2-174高效表达载体.表达后SDS-PAGE分析其表达最高达50%以上.根据G-CSF表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程.首先分离纯化包涵体,8mol/L尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步SP-SepharoseFF柱层析至均质.纯化的G-CSF比活性达3.4×108U/mg蛋白,每升表达菌液回收的G-CSF总活性达1.06×1011U.纯化产物的N-端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性 相似文献