RIG-I敲除293T细胞系的建立及其对B型流感病毒复制的影响

CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的单向导RNA(Single-guide RNA,sgRNA)指导Cas9蛋白对目的基因靶位点进行特异性的识别、结合和切割后,通过细胞的非同源末端连接或同源末端重组修复机制来完成对基因组的敲除与敲入的编辑技术。RIG-I是机体的一种模式识别受体,能够识别胞质中的含5′-三磷酸基团的RNA,并通过与下游信号分子MAVS相互作用,激活IRF3/7和NF-κB,从而启动I型干扰素和炎性因子的表达。已有研究表明,B型流感病毒(IBV)在感染早期能够上调RIG-I的表达水平。为了探索RIG-I是否为B型流感病毒激活抗病毒天然免疫信号通路的主要受体及其对IBV复制的影响,本研究利用CRISPR-Cas9技术对293T细胞中的RIG-I基因进行了敲除,经嘌呤霉素压力筛选到了一株稳定敲除RIG-I基因的293T(RIG-I-/-293T)细胞系。Western blotting检测发现,IBV或仙台病毒感染后该细胞系中RIG-I不再表达,说明该敲除细胞系构建成功。IBV感染RIG-I-/-293T细胞后,干扰素、炎性因子及干扰素刺激基因的转录水平与野生型293T细胞相比明显下降,并且在RIG-I-/-293T细胞中检测不到p65和IRF3磷酸化,表明IBV感染早期细胞因子的表达主要依赖于RIG-I信号通路的激活。IBV在野生型及RIG-I-/-293T细胞中的多步生长曲线表明,RIG-I可抑制IBV的复制。以上结果表明,RIG-I敲除的293T细胞系构建成功,RIG-I是IBV激活下游抗病毒天然免疫信号通路的主要受体之一,且对IBV的复制具有负调控作用,该研究为探索IBV的感染机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌耐药相关单碱基突变的计算方法比较

[目的] 耐药结核分枝杆菌（drug-resistant Mycobacterium tuberculosis）的产生给结核病（tuberculosis）的治疗带来巨大困难。[方法] 使用基于全基因组测序的关联分析探究耐药强相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）突变,主要有GEMMA、phyc、plink。为了阐明其中最优的耐药相关SNP计算方法,本研究下载NCBI上已有的1504株结核分枝杆菌数据,并获取它们对于3种常见的一线抗结核治疗药物（isoniazid、rifampicin、ethambutol）的耐药性检验结果。并使用这3种耐药相关SNP计算方法计算与结核分枝杆菌耐药相关的SNP;并评估计算得到的耐药相关SNP在预测耐药表型的敏感性和特异性。[结果] 发现通过phyc可以预测到最多的已知耐药相关SNP和最少的耐药无关SNP,而且phyc预测的耐药相关SNP的敏感性和特异性恒定大于52.49%。[结论] phyc在预测结核分枝杆菌耐药相关SNP中结果最准确,但考虑到运行时间和表型数据的更新,GEMMA和plink的结果也应作为参考。     

基于深度学习的蛋白质建模与设计

随着蛋白质序列及结构数据的大量累积,在获得了大量描述性信息之后如何有效利用海量数据,从已有数据中高效提取信息并且应用到下游任务当中就成为了研究者亟待解决的问题。蛋白质的设计可使新蛋白的研发不再受限于实验条件,这对药物靶点预测、新药研发和材料设计等领域具有重要意义。深度学习作为一种高效的数据特征提取方法,可以通过它对蛋白质数据进行建模,进而加入先验信息对蛋白质进行设计。故此基于深度学习的蛋白质设计就成为一个具有广阔前景的研究领域。文中主要阐述基于深度学习的蛋白质序列与结构数据的建模和设计方法。详述该方法的策略、原理、适用范围、应用实例。讨论了深度学习方法在本领域的应用前景及局限性,以期为相关研究提供参考。     

干扰素膜蛋白Tet-on系统稳定细胞系的建立及对CA16病毒的抑制作用

通过Tet-on调控系统,构建受多西环素诱导表达干扰素诱导的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane proteins 1/2/3,IFITM1/2/3)基因的HeLa细胞系,并初步探索了IFITM蛋白对柯萨奇病毒A16(CA16)的抑制作用.首先将调控质粒pTet-on转染进入HeLa细胞,通过G418筛选出阳性克隆细胞系,在此细胞系基础上共同转染反应质粒pTRE2-IFITM1/2/3和伴侣质粒pTK-Hyg,通过潮霉素筛选出单克隆细胞系,加入多西环素后利用Western印迹筛选出可诱导表达IFITM1/2/3蛋白的单克隆细胞系.使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现,多西环素诱导表达的IFITM蛋白对不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的CA16具有明显的抑制作用,其中IFITM 3对CA16的抑制效果最为明显.Tet调控IFITM1/2/3基因表达HeLa细胞系的成功建立,为进一步研究IFITM基因的功能及其抗病毒机理提供了一个理想的细胞模型.     

抗菌肽magainin Ⅱ的密码子优化及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

Magainin Ⅱ是非洲爪蟾皮肤分泌的一种抗菌肽,在低浓度下即能够对细菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有杀伤作用,并且与同是来源于非洲爪蟾皮肤的另一种抗菌肽PGLa在杀菌、抗肿瘤等方面具有很好的协同效应。文中分别按照大肠杆菌和毕赤酵母的密码子利用频率,对抗菌肽magainin Ⅱ以及杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa,进行了密码子优化。构建了高效表达抗菌肽magainin Ⅱ的原核表达载体,经过蛋白酶切割获得纯化的抗菌肽magainin Ⅱ。同时进一步构建了杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体,实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。本研究为magainin Ⅱ和magainin Ⅱ-PGLa的生产与应用奠定了基础。     

肠道微生物菌群共存网络的构建与分析

【目的】将网络分析应用到肠道微生物的分析之中,探究肠道微生物共存网络拓扑结构等相关网络系数的分析,从而展现肠道微生物共存网络的特性。【方法】将之前研究中的肠道微生物数据根据雌马酚代谢能力划分成雌马酚产生者和非产生者两组,计算两组微生物相对丰度,得出菌种之间的相关系数,构建肠道微生物的共存网络,分析两组间共存网络参数的差异;运用随机网络检验现实网络拓扑结构的特异性,分析两组网络中菌种间的差异。【结果】共存网络中两组节点数分别为45个和47个,即分别有45个和47个不同菌种。比较两组网络结构的差异,发现雌马酚产生者组中的共存网络菌群具有更复杂的连接,且两组之间的其他网络参数存在一定的差异。通过将现实网络与随机网络对比可知,现实网络的拓扑结构具有一定的特异性。将具有代谢雌马酚相关物质能力的菌种在两组网络中标出,发现它们在雌马酚产生者组共存网络中更趋向与来自不同门的菌种产生相互联系。【结论】将网络分析应用于肠道微生物分析之中,可以发掘菌种之间的相互作用和网络拓扑结构的复杂性与差异性,展现肠道菌群结构中之前较少被认识到的一些特征。因而,网络分析的方法可以为未来肠道微生物的研究提供新的视角。     

一种超高灵敏的埃博拉病毒胶体碳侧流免疫层析检测方法的建立

埃博拉出血热 (Ebola hemorrhagic fever, EHF) 由于其高感染性和高致死率特点,快速鉴别诊断并实施隔离是最有效的防止疫情扩散的措施。文中建立了一种可以快速、高灵敏筛查埃博拉病毒 (Ebola virus,EBOV)感染的现场检测技术,用碳纳米颗粒标记抗EBOV基质蛋白VP40兔多克隆抗体,组装成一种可在15 min内检测埃博拉病毒的胶体碳侧流免疫层析试纸条。将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫;以1 mg/mL的抗VP40单克隆抗体 (McAb,4B7F9) 和羊抗兔IgG,按照2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异地检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP) 和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒 (MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8 (IAV/PR/8)、黄热病毒 (YFV-17D)、登革热病毒2型 (DEN2) 无交叉反应,显示良好的特异性,对1 500份阴性血清进行检测,假阳性率为1.3‰,仅为WHO授权ReEBOV?胶体金试纸的1/100;该胶体碳试纸条检测灭活EBOV的最低检出限为100 ng/mL (相当于106 copies/mL),远优于ReEBOV?胶体金试纸条检出限 (10 μg/mL,相当于108 copies /mL)。热稳定性评价显示试纸条可在室温稳定保存1年以上。文中建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、超高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。     

B型流感病毒研究进展

B型流感病毒为单股负链分节段RNA病毒,常在全球范围内以与A型流感病毒共流行的方式引起流感的局部暴发或季节性流行,对儿童、青少年、老人等特定人群易感,且感染儿童及青少年后引起的死亡率较高,给人类的公共卫生健康造成了严重威胁。B型流感病毒与A型相比更容易引发患者发生并发症,且其在流行季节造成的疾病负担甚至超过A型。近期,特别是2017年入冬后,B型流感病毒在我国的很多地区成为了引起流感发生的优势毒株,给人们的健康生活带来极大困扰。鉴于此,文中从B型流感病毒的结构、流行病学、免疫学及防治等方面进行了综述,旨在增强人们对该病毒的认识,为B型流感的防控提供借鉴和参考。     

精准医疗与肿瘤免疫治疗伴随诊断

以免疫检查点阻断疗法为代表的肿瘤免疫治疗在肿瘤临床治疗中取得了突破性进展,然而肿瘤免疫治疗伴随诊断仍存在诸多困难。在当前精准医疗大发展的背景下,创新性的技术和方法不断应用到肿瘤免疫治疗的伴随诊断中,对于提高肿瘤免疫治疗的效率具有重要意义。现有研究发现肿瘤微环境PD-L1的表达检测、肿瘤突变和肿瘤变异新抗原分析、肿瘤微环境免疫相关基因表达谱分析等方法与肿瘤免疫治疗效果具有显著相关性,然而其临床应用仍具有一定局限性,导致精准的肿瘤免疫治疗伴随诊断仍面临诸多挑战。主要介绍了免疫检查点阻断治疗相关伴随诊断领域研究进展,提出肿瘤免疫治疗伴随诊断需要开放式思维,积极引入新技术新方法,拓展多元化分子标识,从而推动肿瘤免疫治疗实现个体化精准应用。     

不同亚型流感病毒NS1蛋白的细胞定位差异分析

NS1蛋白是流感病毒编码的一种小分子多功能蛋白,可在病毒的复制过程中抑制宿主细胞的抗病毒免疫应答。为研究不同亚型流感病毒的NS1蛋白在细胞内的定位差异,分别用H1N1亚型WSN、PR8和CA04毒株,H9N2亚型SD毒株及H7N9亚型AH01毒株感染A549、MDCK细胞系以及构建的可表达不同亚型流感病毒NS1蛋白的p CMV-Myc-NS1质粒转染293T细胞,用激光共聚焦显微镜观察发现不同亚型流感病毒在不同细胞系和时间点的定位差异,感染后24 h时WSN和PR8毒株的NS1主要定位于细胞质中,而CA04和SD毒株主要定位于细胞核内。另外,观察过表达的WSN、SD和AH01毒株NS1的细胞定位,转染后24 h时WSN毒株NS1定位于细胞质中,而SD和AH01毒株主要定位于细胞核中。经氨基酸序列比对,对WSN毒株NS1蛋白进行关键氨基酸点突变,结果显示单一位点的改变未导致NS1蛋白细胞定位的改变,其细胞定位的差异不是由单一位点决定的。综上所述,分析不同亚型中的NS1的定位差异,这对进一步了解NS1蛋白同宿主细胞不同区域的蛋白的相互作用、流感病毒的调节机制以及病毒感染细胞中天然免疫反应具有一定的指导意义。