一株铅黄肠球菌噬菌体的生物学特性和全基因组分析

【目的】铅黄肠球菌是医源感染的机会致病菌,可引起危及生命的败血症、脑膜炎等,但针对其噬菌体的研究尚属空白。噬菌体作为细菌病毒,具有宿主特异性。本研究首次分离到可培养的铅黄肠球菌烈性噬菌体,对其基因组序列的分析和其他特征研究为进一步探讨噬菌体与宿主的作用机制及治疗应用提供参考。【方法】噬菌体Ecf_virus_SZ01以健康人粪便中分离的铅黄肠球菌(DO55)作为宿主菌,分离自深圳市南山区未经处理的生活污水样本,利用透射电镜观察噬菌体形态并对其生物学特征和基因组特点进行研究。【结果】透射电镜显示,噬菌体Ecf_virus_SZ01头部直径约为106 nm,尾部直径约为150 nm,尾长且无伸缩性尾鞘,属长尾噬菌体科;该噬菌体的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线显示,潜伏期约为30 min,每个受感染细胞产生子代的平均数量为50 PFU/cell;抑菌曲线显示MOI=0.01时对宿主菌具有很好的抑制效果;宿主特异性强,不能实现跨属侵染;测序结果显示其基因组为dsDNA,长度为59 409 bp,GC含量为43.2%;该噬菌体共有102个开放阅读框,BLASTn比对显示该噬菌体与NCBI数据库中其他噬菌体相似性极低。【结论】首次分离到宿主为铅黄肠球菌的噬菌体,具有潜伏期短、裂解能力强、宿主专一的特征,基因组与数据库中现有噬菌体相比十分新颖,并对其生物学特性和基因组进行了分析。     

嗜热毁丝霉高通量培养技术及其应用

【背景】丝状真菌是一类重要的工业发酵生产宿主菌,如何进行高通量纯菌培养和高效检测筛选性能优异的菌株是工业丝状真菌研究的重要方向。【目的】研究建立丝状真菌的高通量培养技术并测试应用效果。【方法】通过对丝状真菌培养过程中的制种、接种、培养和检测研究,建立基于孔板的高通量培养技术,并以嗜热毁丝霉为例对该技术进行验证。【结果】与传统的平板制种和摇瓶接种培养方式相比,高通量孔板的培养方式将制种通量提高24倍,单位面积产孢子能力提高350%,液体培养转接效率提高10-40倍,并建立96孔板测定乙醇含量的高通量检测技术。【结论】将丝状真菌的培养和检测通量提高1-2个数量级,为快速检测丝状真菌改造过程产生的大量性状不同菌株并获得目标菌株奠定基础,为丝状真菌高通量筛选研究提供应用指导价值。     

青蒿植物内生链霉菌中的质粒pCQ4与噬菌体ΦCQ4

【目的】在青蒿植物的内生链霉菌W75中检测到一个大的环型质粒pCQ4。克隆、测序、分析和功能研究pCQ4。【方法】Southern杂交确定质粒的酶切图谱,利用接合转移和同源重组方法将质粒克隆到了大肠杆菌BAC衍生的载体上,并进行鸟枪测序和分析。【结果】获得了全长为84833 bp的pCQ4序列,预测编码129个基因,其中成簇的40个基因与其它噬菌体的基因同源。实验证明含有质粒pCQ4的菌株能够低频率释放噬菌体ФCQ4,并可以侵染消除了pCQ4的W75X孢子和形成噬菌斑。在透射电镜下观察到噬菌体颗粒,脉冲场凝胶电泳显示ФCQ4为线型DNA。pCQ4与已发表的链霉菌质粒-噬菌体pZL12比对,编码噬菌体的主要结构蛋白的基因是相似的。【结论】链霉菌大的质粒pCQ4也可以转化为噬菌体ФCQ4,其噬菌体相关的基因簇可能是可转移的单元。     

合成生物学展望——合成、重构和改造微生物基因组

合成生物学是生物科学领域住21世纪刚刚出现的一个新的分支学科,作为一门新兴的交叉学科,与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的办法不同,合成生物学的研究方向是从最基本的要素开始一步步建立零部件。与基因工程把一个物种的基因延续、改变并转移至另一物种的作法不同,合成生物学的目的在于建立人工生物体系,让它们像电路一样运行。     

单病毒示踪

病毒是一类细胞内寄生的微生物,由其引发的感染性疾病对人类健康、民生、经济等造成极大威胁.病毒侵染宿主细胞是一系列动态、精细、复杂的过程,涉及病毒与细胞多组分间的相互作用,采用传统的分子生物学手段无法实现对病毒关键生命环节的精准解析.单病毒示踪则为单个或多个病毒生命周期的原位、实时可视化研究,及侵染机制的揭示提供了新的途径.本文从单病毒示踪的意义和方法出发,展开介绍:(i)病毒的标记材料和方法;(ii)病毒成像与分析技术;(iii)单病毒示踪的研究现状与趋势,并针对该领域目前存在的问题及未来发展趋势进行探讨.     

细菌信号传导调控元件的合成生物学研究进展

合成生物学的一个重要目标是设计、改造微生物(主要指细菌),使其能够自主执行复杂任务,如合成重要生物基产品(药物、生物燃料等)、疾病治疗以及环境修复等,造福人类社会.要完成这些任务,细菌必须依赖其信号传导系统,根据环境变化作出正确及时的应答.在长期进化过程中,细菌产生了众多不同的信号传导系统,给我们提供了大量宝贵的信号传导调控元件.通过对这些调控元件的合成生物学设计、改造,我们可以给细菌装备全新的信号传导系统,从而使其能够在工业生物技术及生物医学等应用中执行设定任务.     

链霉菌小质粒pDYM4.3k的复制与接合转移

【目的】链霉菌(Streptomyces)X335是从西藏高原活拉山口分离到的,其中含有一个大小为4.3 kb的环型质粒pDYM4.3k。克隆、测序和分析pDYM4.3k,以及鉴定复制和接合转移的基因。【方法】通过克隆和引物延伸获得pDYM4.3k的全序列,利用比对分析推测基因的功能,通过Southern杂交检测复制中间体,利用平板杂交实验证明接合转移功能。【结果】克隆和测序获得了全长为4346 bp的pDYM4.3k序列,预测仅有3个基因,其中1个基因与链霉菌主要接合转移基因同源,另外2个为功能未知。鉴定新的基因orf1及其上游的约300 bp构成了质粒的基本复制区域。检测到质粒存在单链的复制中间体,表明它以滚环方式进行复制。实验证明pDYM4.3k在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中具有接合转移功能。【结论】质粒pDYM4.3k可以滚环方式进行复制和在链霉菌之间进行接合转移。这是目前报道的最小的、具有游离复制和接合转移功能的链霉菌质粒。     

位点特异性重组系统的机理和应用

位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体, 并发生DNA链的切割与交换, 实现靶位点之间的整合、切离或倒位. 这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击, 形成共价中间体, 不需要高能量辅助因子的参与. 由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点, 在基因工程领域得到了广泛的应用. 本文从识别位点的性质、重组酶的组成与结构及催化反应的特点三方面对位点特异性重组的机理进行了全面的阐述, 并对当前重组酶的应用研究之现状、热点及存在的问题作了深入剖析, 并讨论了未来的发展趋势.     

五个链霉菌线型质粒端粒的克隆和分析

本室从西藏采集的土壤样品中分离到了一批链霉菌,利用脉冲电泳确定了其中5株链霉菌含有较小的线型质粒。【目的】克隆、测序和分析5个线型质粒的端粒。【方法】采用改良的"在凝胶中进行DNA碱处理和限制性内切酶酶切"的方法来克隆线型质粒的端粒DNA。【结果】克隆和测序了5个线型质粒的端粒DNA。通过与链霉菌典型端粒进行比较,发现这5个新的线型质粒的端粒序列同样含有多个回文序列。但是有的端粒保守的回文序列I不一定能够"折返"与内部序列配对形成"超级发卡"结构,回文序列的"突出环"不一定都为3nt。【结论】采用改良的方法克隆和鉴定了5个线型质粒新的端粒序列,这些新端粒的特征暗示:回文序列I的"折返"和3nt的回文序列的"突出环"不是端粒复制必需的。     

枯草芽胞杆菌基因组混组方法

基因组混组作为一种育种方法,通过循环原生质体融合等手段,使得不同菌株来源的基因组能够得到充分重组,增加将正向突变整合到同一重组子中的机会。使用4株带有4种不同标记的枯草芽胞杆菌亲本为初始菌株,通过循环转化、循环转导或循环原生质体融合的手段进行基因组混组,统计后代中非亲本类型占整个群体的比例,以衡量基因组混组的效果。分别经过5轮循环原生质体融合、循环转化或者循环转导,结果显示,重组程度较高者在后代群体中的比例较低,带有4种标记的后代未出现,带有3种标记的后代最高分别为4.53×10?4、1.64×10?4、4.47×10?3,明显低于文献报道的天蓝色链霉菌中同样实验的结果:带4种和3种标记的后代分别占2.5%、17%。对比上述实验的结果和文献报道的天蓝色链霉菌、乳杆菌基因组混组的结果,并结合计算机模拟循环融合过程,分析后认为:要达到较充分的基因组混组,需要有能够实现微生物细胞间高频重组的操作技术作为基础,重组频率应该不低于10?3～10?2数量级。