基于合成生物学的微生物制造研究进展

基于合成生物学的微生物制造在天然产物药物、生物能源、生物基化学品及生物传感器件的研究中发挥越来越重要的作用。本文系统地介绍了合成生物学研究领域的最新技术进展,包括DNA和染色体合成、新生物元件开发与元件库标准化、染色体工程与最小基因组技术、途径装配技术等,并阐述了合成生物学在微生物制造领域内所取得的突破和巨大的应用价值。     

HD-Zip III转录因子家族与植物细胞分化

细胞分化是生物生长发育的重要过程, 受到一系列信号的精确调控。植物特有的转录因子HD-Zip III在细胞分化中发挥了重要作用。该文对HD-Zip III基因类型和结构特点进行了简要介绍, 重点论述了HD-Zip III在胚胎形态发生、顶端分生组织形成、叶极性建立和维管组织分化等发育过程中的作用, 系统总结了HD-Zip III基因在不同层次受到的调控, 探讨了该家族基因与陆生维管植物进化的关系。     

合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑

合成生物学作为一门新兴学科,其目标主要有两点:一是利用非天然的分子使其出现生命的现象,也就是―人造生命‖;二是―改造生命‖,比如利用一种生命体的元件(或经过人工改造),组装到另一个生命体中,使其产生特定功能。无论是哪种目的,对生命遗传物质DNA的操作都非常关键,其具体包括DNA的从头合成、组装和编辑等。同时,这些使能技术的进步也促进了合成生物学其他领域的发展。本文介绍了DNA操作相关的合成生物学使能技术的最新进展。     

共表达极端菌伴侣蛋白prefoldin提高P450 BM3突变体催化效率

P450 BM3来源于巨大芽孢杆菌,其突变体(A74G、F87V、L188Q、D168H)能够在大肠杆菌细胞内催化吲哚合成靛蓝．然而在常规的培养条件下(37℃,250 r/min),大肠杆菌细胞内靛蓝的生物转化量极低．本文将极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的分子伴侣蛋白与P450 BM3突变体在大肠杆菌进行共表达,以研究分子伴侣蛋白是否能够提高靛蓝的生物转化量．实验结果表明,极端嗜热古菌的分子伴侣蛋白prefoldin能够显著提高靛蓝的产量．同时,实验结果发现prefoldin能够明显提高大肠杆菌细胞内的NADPH/NADP+比率．鉴于NADPH是参与靛蓝生物转化过程的重要因素,靛蓝生物转化量的显著增加可能与该比率的提高有关．     

甜叶悬钩子(Rubus suavissimus S.Lee)中UDP-糖基转移酶基因的克隆、表达及序列分析

糖基化是植物次生代谢产物生物合成中重要的修饰反应。目前已报道的以二萜为底物的UDP-糖基转移酶(UGT)数量稀少。本研究基于甜叶悬钩子叶片的转录组数据,利用生物信息学分析手段,选定可能具有二萜类催化活性的UDP-糖基转移酶基因进行克隆。最终克隆得到18条UGT基因序列,在大肠杆菌中进行了异源表达,并对克隆的基因进行了初步的序列分析。本研究为进一步挖掘和验证甜叶悬钩子中UGT的功能奠定了基础。     

鲍曼不动杆菌遗传操作系统研究进展

鲍曼不动杆菌作为一种医院内感染的病原菌,因其易于引起各类感染且耐药性强而受到广泛关注。快速改造鲍曼不动杆菌基因组的工具可有效促进其耐药机制的研究。本文就近些年来适用于鲍曼不动杆菌的遗传操作方法进行了总结,包括各种外源基因转入方法(电转化、自然转化、接合转移)和基因改造技术(等位基因交换、DNA重组工程、转座突变),并对鲍曼不动杆菌的基因组编辑方法的改进作了初步展望。     

小葱植物内生链霉菌线型质粒pYY8L的端粒与复制区的克隆和鉴定

从小葱植物中分离到一株编号为36R-2-1B的链霉菌菌株,该菌株含有一个约为280kb的线型质粒pYY8L。【目的】克隆、测序和分析pYY8L新的端粒和复制区。【方法】采用改良的"在凝胶中进行DNA碱处理与酶切"的方法来克隆大的线型质粒pYY8L的端粒,通过构建基因组柯斯文库和次级克隆的方法来缩小和鉴定pYY8L的复制区。【结果】在小葱植物内生链霉菌36R-2-1B中检测到约为280kb的线型质粒pYY8L,克隆了pYY8L的端粒。其末端的152bp包含6个小的回文序列,可以形成复杂的二级结构。利用柯斯文库构建、次级克隆和测序获得了4891bp的pYY8L的复制区。该复制区含有6个基因,其中2个与天蓝色链霉菌线型质粒SCP1的复制基因非常相似,但是邻近的重复序列不同。【结论】采用新的改良的方法克隆和鉴定了pYY8L新的端粒和复制区。本文首次报道了植物内生链霉菌线型质粒的端粒和复制基因。     

利用合成调控RNA技术提高大肠杆菌异源合成红霉素前体6-脱氧红霉内酯B产量

红霉素为代表的聚酮类化合物已经成功的在大肠杆菌中实现了异源合成,但其产量仍然较低(仅~10 mg/L)。本研究基于大肠杆菌全基因组代谢模型iAF1260,利用通量平衡分析预测了红霉素母核6-脱氧红霉内酯(6-Deoxyerythronolide B,6-d EB)生物合成的关键靶点,通过合成调控RNA技术(Synthetic small regulatory RNAs,sRNAs)对预测的靶点进行验证。结果表明,以弱化lsrC(编码LsrABC转运蛋白)和ack A(编码乙酸激酶蛋白)为代表的关键靶点改造可以显著提高6-d EB异源合成,提高幅度可达48.7%。通过弱化靶点的组合,进一步改善了6-d EB的异源合成,产量最终可达22.8 mg/L,比出发菌株产量提高59.9%。本研究发现和确认了6个有效的调控靶点,最终成功地改善了6-d EB在大肠杆菌中的异源合成。研究表明,通量分布比较分析结合sRNAs技术是一种有效的方法提高6-d EB异源合成,也为改善其他代谢产物的异源合成提供了可供借鉴的研究思路。     

嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor sp. F32中降解β-1,3-1,4葡聚糖水解酶的协同性分析及糖基化对F32EG5热稳定性影响

【目的】通过研究来自极端嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor sp. F32中3个可降解β-1,3-1,4葡聚糖(β-葡聚糖)的糖苷水解酶,解析其在降解β-葡聚糖过程中协同作用,以及异源表达的糖基化修饰对β-葡聚糖酶F32EG5热稳定性的影响,为该系列水解酶的应用提供考据。【方法】通过大肠杆菌异源表达β-葡聚糖酶F32EG5和Lam16A-GH,以及β-葡萄糖苷酶BlgA,利用DNS、TLC等方法检测其在β-葡聚糖降解过程中的协同性及底物耐受能力。随后,利用毕赤酵母对F32EG5进行异源表达,以及对糖基化修饰的p-F32EG5进行酶学对比。【结果】β-葡聚糖酶F32EG5和Lam16A-GH单独作用于底物时,水解产物不同。但混合使用时,低聚合度寡糖的比例增加。β-葡萄糖苷酶BlgA分别与F32EG5和Lam16A-GH复配时,均展示出良好的协同效应和底物耐受能力。此外,利用毕赤酵母异源表达的p-F32EG5,没有明显改变其最适pH和最适温度,但在超高温下(80–90°C)的热稳定性和催化效率相对于未被糖基化的F32EG5提高2倍以上。【结论】葡萄糖糖苷水解酶BlgA分别与β-葡聚糖酶F32EG5、Lam16A-GH复配,在水解β-葡聚糖过程中表现出良好的协同性和底物耐受能力,同时毕赤酵母异源表达的糖基化修饰能提高在超高温环境下的热稳定性能,有利于酶制剂生产造粒过程中的酶活保留,从而使F32EG5具备应用化潜力。     

高通量分析技术在资源微生物及功能基因发掘中的应用

随着新的微生物资源不断被发现以及微生物基因组测序数据的积累和完善,目前研究重点和难点是如何从大量数据中快速发现和鉴定与微生物重要表型相关的功能基因,这就需要高通量的分析研究手段,主要涉及建库和筛选两个主要技术单元。其中,建库是指构建能够覆盖微生物全基因组的突变或干扰文库,所涉及的技术包括宏基因组、转座子插入突变、RNA干扰(RNA interference,RNAi)、反转录子文库重组工程(retron library recombineering,RLR)、CRISPR抑制(CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPRa)等。筛选则是通过某种胁迫压力来促使文库菌群的差异化生长,并结合高通量测序全面发掘与特定表型相关的功能基因,从而为后续研究提供有效信息。本文对功能基因组学研究中现有的高通量分析技术进行了梳理、总结和展望,以期为这类技术方法的拓展、优化以及应用提供参考。