革兰氏阴性菌膜间质蛋白酶DegP研究进展

膜间质蛋白酶(DegP),是一种广泛存在于真核生物和原核生物细胞中的蛋白。DegP同时具有酶活性和分子伴侣活性,并通过多聚体构成胶囊状结构执行其分子伴侣功能。DegP的酶活性依赖酶切位点与PDZ1结构域双重识别方式识别底物,这种识别模式被称为"分子量尺"。在革兰氏阴性菌中,DegP主要位于膜间质,通过分子伴侣活性与酶活性帮助保护错误折叠蛋白或降解变性蛋白。DegP也参与外膜蛋白的转运,是DegP胞内活性的研究重点。DegP也可以被分泌到胞外,帮助宿主对抗恶劣环境,并参与调节生物被膜的形成。本文将从DegP的结构与活性、胞内功能与胞外功能三大方面对DegP的研究进展进行总结,为革兰氏阴性菌周质中蛋白质质量控制与DegP体外功能的进一步研究提供参考。     

圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的原核表达及其抑制剂的筛选

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标。本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂。【方法】通过PCR扩增SLEVNS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台。【结果】SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95%以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行。对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEVNS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性。【结论】本研究为SLEVNS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物。     

通过优化表达元件及培养基组分提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量

【背景】碱性丝氨酸蛋白酶(Subtilisin)是一种具有广泛用途的工业酶制剂。【目的】旨在通过优化启动子、信号肽及培养基组分来提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量。【方法】以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株,构建了含有4种不同类型启动子(PbacA、P43、PaprE和PsrfA)及4种不同类型信号肽(SPVpr、SPSacB、SPSacC和SPAprE)的碱性丝氨酸蛋白酶表达菌株,并在获得高产菌株的基础上进行培养基优化。【结果】4种启动子的表达水平为PbacAPaprEP43PsrfA,4种信号肽的分泌效率为SPAprESPSacCSPSacBSPVpr。其中,菌株BL10/pPbacA-aprE产生最高的碱性丝氨酸蛋白酶酶活(275.21 U/mL),相比于出发菌株BL10/pHY-aprE (167.98 U/mL)提高了64%。随后,通过对发酵培养基成分进行优化并结合正交优化,获得了一种高产碱性丝氨酸蛋白酶的培养基(g/L):玉米淀粉40.0,豆粕50.0,(NH4)2SO4 4.0,K2HPO4 3.0,CaCO3 1.0。最后,碱性丝氨酸蛋白酶酶活提高到747.37 U/mL,是初始酶活的4.45倍。【结论】为工业化高产碱性丝氨酸蛋白酶提供了一种有效策略。     

烟草甲clip丝氨酸蛋白酶基因的克隆及其对外源激素和免疫胁迫的表达响应(英文)

【目的】作为细胞外信号级联通路的重要组成部分,含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases, CLIPs)在昆虫发育和先天免疫过程中起着重要作用。本研究旨在克隆烟草甲Lasioderma serricorne CLIP基因,解析其在烟草甲不同发育阶段和幼虫不同组织中的表达模式,分析其在外源激素20-羟基蜕皮酮(20E)和免疫胁迫后的表达特征,为进一步研究其生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆获得烟草甲两个CLIPs基因(LsCLIP1和LsCLIP2)全长cDNA序列,并利用生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和特征,利用MEGA 6.06构建昆虫CLIPs系统发育树;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)研究这两个基因在不同发育阶段［低龄幼虫(卵孵化后24 h内)、高龄幼虫(4龄以上)、蛹(化蛹后48 h以上)、早期成虫(化蛹后24 h内)和晚期成虫(化蛹后7 d)］、5龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、肠道和剩余组织)中以及注射20E(120 ng/幼虫)和来源于大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖(0.2 μL)后4龄幼虫中的表达模式。【结果】克隆获得烟草甲LsCLIP1和LsCLIP2基因的cDNA全序列,其开放阅读框长度均为1 194 bp,编码397个氨基酸。序列分析显示,其氨基酸序列各自具有一个clip结构域和胰蛋白酶结构域。系统发育分析表明,CLIP1和CLIP2都属于subfamily C CLIPs。qPCR结果表明,LsCLIP1和LsCLIP2基因在所检测的各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,分别尤以蛹期和表皮中表达量最高;经20E和肽聚糖诱导后,烟草甲幼虫体内LsCLIP1和LsCLIP2基因的表达量明显提高。【结论】推测LsCLIP1和LsCLIP2可能参与了烟草甲的蜕皮发育和对免疫胁迫的应激响应。本研究将为后续研究昆虫CLIPs的分子调控提供参考。     

创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,存在于海水及海产品中.该菌主要引起原发性败血症和严重的创口感染.原发性败血症病人多发生低血容量性休克伴多脏器功能衰竭,病死率高.创伤弧菌感染的致病机制至今尚未完全阐明.动物实验发现该菌的毒力可能包含诸多因素,如胞外溶细胞素(VVC)、金属蛋白酶(弹性蛋白分解酶)、荚膜多糖(CPS)等.VVC是由结构基因vvhA编码的一种相对分子质量(Mr)为50 851的细胞外蛋白质,是一种能使细胞形成孔道的细胞毒素和溶血毒素,是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具水溶性,对热不稳定,能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,具有血管渗透因子活性.经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人同样的临床和病理表现,毫克以下水平即可对实验鼠致死.VVC在创伤弧菌感染致病机制中的确切地位尚有争议,但因其具有穿孔特性而颇受人们关注.目前对VVC的细胞毒性机制已有广泛研究和报道,但其确切机制尚未完全明了.本文将近年来国外有关研究的情况作一综述.     

金雀异黄素抑制IL-1α刺激破骨样细胞的组织蛋白酶K表达

从人骨巨细胞瘤组织中纯化破骨样细胞,用不同浓度的金雀异黄素温育48h,观察IL-1α刺激后1h后组织蛋白酶K表达。结果发现:与阴性对照组相比,IL-1α明显刺激破骨样细胞表达组织蛋白酶K(P<0.01);而金雀异黄素抑制IL-1α刺激后组织蛋白酶K转录及表达,且呈剂量依赖关系(P<0.01);加用雌激素受体拮抗剂ICI182.780后,金雀异黄素作用被部分拮抗。金雀异黄素通过雌激素受体部分抑制IL-1α刺激破骨样细胞的组织蛋白酶K表达。     

转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟幼虫几种主要酶系活性的影响

研究了表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (uenée) 幼虫解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶活性的影响,测定比较了取食转Bt基因玉米后幼虫体内α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力。结果表明,取食转Bt基因玉米48 h后亚洲玉米螟幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽S转移酶活力明显低于对照;而乙酰胆碱酯酶活力显著高于对照,在取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的2.00、1.50和2.50倍。保护酶系、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性在取食48 h后明显受到抑制;但强碱性类胰蛋白酶的活性显著高于对照,取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的4.00、1.67和1.33倍。乙酰胆碱酯酶和强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt的抗性有关。     

人sBCMA cDNA的克隆、高可溶性融合表达及活性分析

BCMA是除TACI外BAFF和APRIL共用的另一细胞表面受体。为了研究sBCMA作为拮抗受体的可能及获得活性sBCMA蛋白用做结构功能研究,我们以RTPCR法从人B系非洲淋巴瘤细胞株Raji总RNA中扩增出人BCMA的全长cDNA,经克隆测序证实所克隆的基因为人BCMA。继而通过嵌套PCR扩增出胞外可溶区(sBCMA,46个氨基酸组成,含有一个6个半胱氨酸的保守CRD,构成3个二硫键)cDNA,构建原核表达载体pET43.1a( )sBCMA,在大肠杆菌菌株OrigamiB(DE3)pLysS中高可溶性融合表达出重组蛋白sBCMANusAHis6,同时克隆表达了融合蛋白NusAHis6。经Ni NTA亲和纯化后的目的蛋白进行细胞学实验表明sBCMA能特异阻断BAFF促小鼠B细胞的增殖作用,而NusAHis6则不能,证实我们所表达得到的受体胞外可溶性片段sBCMA与配体具有较高的结合活性。sBCMA融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考,并为研究其临床应用以及BAFF和APRIL受体结构和功能的关系奠定基础。     

液泡加工酶: 植物中具有胱天蛋白酶功能的蛋白酶

植物的液泡加工酶(VPE)是一类存在于液泡中的半胱氨酸蛋白酶家族,最近被发现与动物细胞的胱天蛋白酶(caspase)在调控细胞的PCD(细胞程序性死亡)方面具有相似性。文章综述了VPE调控植物细胞程序性死亡的研究进展,从结构、功能和作用机制方面讨论了液泡加工酶与胱天蛋白酶的相似性。