人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

以lacF基因为食品级选择标记,构建了乳酸乳球菌食品级基因表达系统,并进而实现了人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达。首先构建了含有lacF基因两侧同源DNA序列(0.5kb)的整合型质粒pUCEmDE,通过pUCEmDE与乳酸乳球菌MG5267染色体上单拷贝的乳糖操纵子之间的同源双交换,构建了lacF基因缺失突变的食品级受体菌WZ103 (Lac-),并经PCR及Lac表型检测所验证。然后构建了互补质粒pMG36eF,其lacF基因的表达受组成型的强启动子P32的控制。将其电转化导入WZ103后,Lac+表型得到恢复,表明WZ103中lacF基因的功能可被互补质粒pMG36eF上的lacF基因互补。随后,以互补质粒pMG36eF为基础,构建了不含任何抗生素抗性选择标记的人铜锌超氧化物歧化酶基因的食品级表达质粒pWZ104。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SOD活性凝胶染色分析,检测到WZ103(pWZ104)中Cu/Zn SOD的表达,并且具有生物活性。     

链霉菌负调控因子突变筛选系统的构建

摘要:【目的】构建用于阻遏链霉菌隐性次级代谢基因簇表达的负调控因子筛选的报告系统。【方法】通过“REDIRECT (Rapid Efficient Directed Recombination Time Saving)”技术结合链霉菌温和噬菌体BT1整合酶的体内位点特异性重组技术,对链霉菌中多基因进行无痕敲除。以链霉菌隐性次级代谢基因簇中受阻遏的启动子驱动链霉菌中保守的inoA 构建报告质粒,针对阻遏次级代谢基因簇表达的负调控基因的突变进行检测,以验证报告系统的可行性。【结果】本研究首先通过对天蓝色链霉菌的肌醇从头合成途径关键酶基因inoA,及合成黄色聚酮类隐性抗生素(yellow cryptic polyketide,yCPK)的途径特异性负调控基因scbR2依次进行了无痕敲除,以构建进一步筛选所用的受体菌,再以scbR2阻遏的cpkO启动子控制inoA 的表达构建了报告质粒pIJ8660::PcpkO::inoA。结果显示沉默的cpkO 启动子在突变的受体菌中被激活并使inoA得到了表达,可以使inoA的光秃型突变表型在不添加肌醇的培养基上恢复到产孢的野生型表型。【结论】inoA可以作为新的链霉菌普遍适用的报告基因,可方便地通过表型变化的观察进行筛选,同时可针对性对负调控基因的突变进行检测,可应用于链霉菌隐性抗生素激活的研究。     

链霉菌形态分化基因——白基因的研究

白基因(ｗｈｉ)是一类在链霉菌形态分化过程中具有重要作用的基因。由于这些基因的突变阻断了气生菌丝到孢子形成这一形态分化过程,相应的突变株在延时培养条件下仍保持白色的表型而得名。1972年,Ｈｏｐｗｏｏｄ和Ｃｈａｔｅｒ将50多个天蓝色链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ)白色突变株分成9个形态类型(ｗｈｉＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｆ,Ｇ,Ｈ,和Ｉ),并通过遗传作图将它们定位在了8个不同的基因位点上[1]。1975年,Ｃｈａｔｅｒ等通过分析双突变株的表型确定了五个白基因(ｗｈｉＡ,Ｂ,Ｇ,Ｈ和Ｉ)的上位关系[2]。在上述已确定的8…     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约１０ｋｂ的ＤＮＡ片段。对其中１．８ｋｂ的ＰｖｕⅡ－ＳａｃⅡ片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有１１７０个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为４４７位的ＡＴＧ,终止密码子为１６１４位的ＴＧＡ,推测其编码一个３８９个氨基酸的蛋白质产物。利用ＢＬＡＳＴＸ程序进行了分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体     

酵母超氧物歧化酶高产菌的选育

采用常规筛选方法从300多株不同种属的酵母菌中筛选到两株细胞生物量和超氧物歧化酶(SOD)含量都较高的菌株(酿酒酵母,编号为Y-8和Y一111)作为实验出发菌.经单倍体分离、N-甲基-N-亚硝基-N’-硝基胍(MNNG)诱变和群体杂交等手段,从中选育出一株细胞生物量略高于实验出发菌、超氧物歧化酶高达1350U/g湿菌体的SOD高产菌株(编号为ZDF-48),它的SOD产量分别为实验出发菌株Y-8和Y-111的2.2 倍和2.4倍.经分离纯化后蛋白含量及超氧物歧化酶活性测定等研究,证明我们选育出的ZDF-48是一株生产超氧物歧化酶的优良品系.     

酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究

通过对410余株酵母菌进行絮凝测定,从中筛选到5株强絮凝菌。依据不同糖对其絮凝水平的抑制,将5株强絮凝菌分为Flo 1型和NewFlo型。对这两种絮凝型菌株的相关生理生化特性进行了研究。结果表明,Flo 1型菌絮凝只受甘露糖抑制,它对高温(70℃)、蛋白酶E、胰蛋白酶敏感,而对蛋白酶K、糜蛋白酶、Ca\+\{2+\}\,pH有一定耐受性。NewFlo型菌絮凝受甘露糖等多种糖抑制,它对高温(70℃)、各种蛋白酶、Ca\+\{2+\}、pH均较敏感。这两种类型菌株絮凝的最适Ca\+\{2+\}浓度为10mmol/L～1mol/L,最适pH为3.0～45。     

链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

主编寄语北大核心CSCD

在2013年新年来临之际,中国知网（CNKI）传来喜讯——《微生物学报》荣获“2012中国最具国际影响力学术期刊”奖。此奖项是按照在Web of Science中的国际他引总被引频次和国际他引影响因子排序,取全部被选期刊的5％,也称TOP5％期刊。     

甾醇酰基转移酶基因高表达对酵母菌麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到含酵母菌甾醇酰基转移酶基因ARE2编码序列和上游调控序列的DNA片段ARE21及仅含编码序列的DNA片段ARE22。分别以ARE2启动子,乙醇脱氢酶基因ADH1启动子和铜抗性基因CUP1启动子及ADH1终止子为调控元件构建了酵母菌表达质粒pHX2,pHXA2和pHXC2。表达质粒分别转化酿酒酵母单倍体菌株YS58和以前通过细胞杂交构建的麦角甾醇高产菌株YEH56。通过营养缺陷互补和铜抗性筛选到转化子,质粒上的ARE2基因在YS58和YEH56中都实现了活性表达,使细胞内甾醇酯化水平升高,并导致细胞麦角甾醇含量的提高。对转化菌株的培养条件进行了初步研究,在优化条件下,重组转化菌株YEH56(pHX2)、YEH56(pHXA2)和YEH56(pHXC2)的麦角甾醇含量分别是受体菌YEH56 的13、13和14倍。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。