应用于二维电泳细胞蛋白质样品提取的复合蛋白酶抑制剂的优化

阿维链霉菌在复合培养基中生长时合成大量蛋白酶以满足菌体分解有机氮源进行生长代谢的需要。而大量蛋白酶的存在对二维电泳的蛋白质组分析细胞蛋白质样品的提取带来了很大的困难。根据阿维链霉菌胞内蛋白酶的组成,以EDTA、PMSF、Bestatin、Pepstatin和E-64等5种蛋白酶抑制剂为基础,通过单因子实验和正交实验优化得到了高效的蛋白酶抑制剂复合配方。验证实验表明,该复合蛋白酶抑制剂在阿维链霉菌细胞蛋白质样品提取中,具有良好的蛋白酶活性抑制效果。     

拟干酪乳杆菌发酵L-乳酸合成培养基的优化

为开发一种适合于乳酸发酵过程代谢流分析(MFA)的合成培养基,以拟干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei为对象,考察主要营养成分对其生长和乳酸合成的影响.在合成培养基的优化过程中,先确定了影响菌体生长和乳酸合成的主要营养物质及其浓度范围,针对葡萄糖、混合氛基酸、核苷类物质、维生素等生长因子、混合磷源、CaCO3六大类营养成分,使用正交试验法先后设计了六因素五水平和四因素三水平正交试验以及氨基酸梯度试验和氨基酸缺失试验,得到了最佳培养基组成(1L):葡萄糖80g、醋酸钠2g、吐温-80 1 mL、柠檬酸氢二铵1g、金属离子0.72g、混合氨基酸3.925g、核苷类物质0.15g、维生素等生长因子0.075g、混合磷源0g、CaC03 35g.以半合成培养基为对照,考察优化后的合成培养基对菌体生长和乳酸合成的影响.结果表明,菌体在合成培养基中的乳酸产量、产率均比半合成培养基中高.这些结果为L.paracasei的代谢流定量研究莫定了基础.     

高渗提高凝结芽孢杆菌P4-102B菌株的电击转化效率

【目的】凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种非常有工业应用前景的微生物,但遗传转化的困难是限制对其进行代谢工程改造的关键因素。本研究主要考察生长培养基、电击缓冲液、复苏培养基中添加高渗剂如山梨醇、甘露醇等对凝结芽孢杆菌转化效率稳定性的影响,并对凝结芽孢杆菌电击转化条件进行优化。【方法】用穿梭质粒p NW33N电转化凝结芽孢杆菌P4-102B,系统地考察高渗条件下细胞生长阶段、感受态菌体浓度、电击缓冲液组分和复苏培养基组成等因素对转化效率的影响。【结果】同一电场压力下高渗体系转化效率较低渗体系明显提高且稳定性较好,菌体在含有0.5 mol/L山梨醇的LB培养基中生长到OD600为0.8时收集,用SMG[0.5 mol/L山梨醇,0.5 mol/L甘露醇,10%(质量体积比)甘油]电击缓冲液洗涤菌体4次制备感受态,在固定电场强度14 k V/cm、脉冲时间5 ms、1 mm规格的电转杯进行电击转化,电转化后立即加入含有0.5 mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇的LB复苏培养基培养,能够获得最佳的转化效率2.7×102 CFU/μg DNA。【结论】使用高渗电击转化法能够提高电击转化的稳定性和重复性,并且可以获得较高的转化效率。     

中心复合实验设计法优化重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体的培养基和诱导pH

毕赤酵母中猪胰岛素前体(Porcine Insulin Precursor,PIP)的表达受到培养基组成及培养环境的影响。本文首先通过部分因子法设计实验,筛选出影响PIP表达的显著因子。实验结果表明,在试验范围内,甲醇补料量和硫酸铵浓度为正效应因子,诱导pH为负效应因子。在此基础上,经过快速登高法逼近显著因子的最优值后,再在此值附近利用中心复合法设计实验,最终得到了PIP表达的最佳条件。经过多批次实验验证,在此条件下PIP的表达量为120.4mg/L,比优化前的值41.5mg/L提高了将近两倍。     

利用乙腈作为内标气相色谱法快速测定发酵液中的乳酸

建立了一种内标法准确、快速测定发酵液中乳酸含量的方法。色谱柱为2m×3mm(i.d.),内填GDX-103的不锈钢柱,FID检测器。内标为1.0%的乙腈溶液。实验结果表明,该方法的相对标准偏差小于1.0%(n=7),回收率在99%以上。方法具有前处理简单、干扰小、灵敏度高、分析速度快,线性测定范围宽等优点。     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位（由丙二酰CoA提供）和丙酸单位（由甲基丙二酰CoA提供）为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3％,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21％以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响*

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位(由丙二酰CoA提供)和丙酸单位(由甲基丙二酰CoA提供)为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3%,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21%以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

海藻糖对草菇菌种的低温保护效应研究

以生存活力和生长速度、厚垣孢子形成、次生代谢产物变化和基因指纹图谱方法分析了采用海藻糖溶液低温保藏草菇菌种的效果.结果显示:不耐受低温的草菇菌种在海藻糖溶液的保护下,能够在4～6 ℃下具有生存活性至少8个月以上,而且经过低温的草菇菌种其分泌的次生代谢产物种类与采用目前常规保藏方法保藏的草菇菌种一致,遗传稳定性测试结果也显示经过了海藻糖溶液低温保护的草菇菌种的基因指纹图谱没有发生改变;同时采用海藻糖溶液保护的草菇菌种,在4～6 ℃低温下保藏8个月后活化,活化后的菌种采用清水低温保藏,1个月后仍然具有生存活性,并能产生厚垣孢子.