脱氮假单胞菌生产维生素B12过程中粪卟啉Ⅲ的测定及发酵调控

脱氮假单胞菌发酵生产维生素B₁₂过程中,副产物粪卟啉Ⅲ的积累对产物的代谢合成和分离提取有很大的影响。建立了发酵液中粪卟啉Ⅲ的HPLC快速测定方法,发酵液处理后直接进样测定,检测线性范围为12~275 μg/ml,重复性好。研究了不同供氧水平、二氧化碳浓度和pH值对发酵过程中维生素B₁₂和粪卟啉Ⅲ代谢合成的影响,并在120吨发酵罐中进行了发酵过程优化控制。结果表明:在发酵过程产物的合成期控制适当的供氧水平、控制二氧化碳浓度在8.6±0.8%、维持pH值在7.0±0.12能明显抑制卟啉Ⅲ的生物合成,同时使维生素B₁₂产量提高15%。     

微生物发酵过程生理参数检测传感器技术与过程优化

工业生物发酵过程是一个复杂的代谢表达调控系统。阐述了开发和利用先进的发酵过程传感仪表技术,进行环境参数和细胞生理代谢特性参数的实时精确测定,是系统了解和分析工业微生物的宏观与微观代谢特性的基础。实现生物传感器与信息技术、过程多参数智能化过程分析的软件识别系统联合,是构建新型的智能化工业生物过程控制与生产模式、建立生产过程的绿色智能制造新技术的关键。     

增大罐压提高脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的产量

【目的】提高发酵罐的罐压,增加维生素B12的产率。【方法】利用常规代谢通量分析(MFA)方法,对脱氮假单胞菌生产维生素B12的发酵过程进行研究。【结果】发现随着VB12合成速率的加快,磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成草酰乙酸(OAA)的通量明显加大,以满足维生素B12合成对前体的需求。根据该分析结果,对发酵工艺进行了改进,即在脱氮假单胞菌进入合成维生素B12阶段时,提高发酵罐的罐压,增加发酵液中二氧化碳的溶解度,从而强化了羧化回补途径。维生素B12的产率明显增加,发酵160 h的产物浓度为176 mg/L,比对照批次终浓度147 mg/L高出了19.7%。【结论】通过增大罐压提高了脱氮假单胞菌进入合成维生素B12的产量。     

葡萄糖和麦芽糖碳源底物对粪产碱杆菌合成凝胶多糖的胞内代谢流影响*

麦芽糖和葡萄糖对粪产碱杆菌发酵合成凝胶多糖有着显著的影响,为了详细分析两种底物对凝胶多糖合成的影响机制,利用恒化培养实验及稳态碳平衡代谢分析,研究发现在稀释速率为0.1h^-1时,利用麦芽糖和葡萄糖为碳源底物的条件下粪产碱杆菌的微观代谢途径通量有较大的差异。以麦芽糖为底物时凝胶多糖的摩尔得率为53.8%,比葡萄糖为碳源时的摩尔得率(36.9%)高出了45.8%以上。同时以麦芽糖为碳源时HMP途径的绝对代谢通量比葡萄糖时的通量提升了40%以上。这条途径通量的增加,提升了NADPH还原力供给速率,促进了依赖于还原力NADPH的凝胶多糖合成途径通量,提升了碳源底物向产物的摩尔转化速率。而且代谢流分析结果显示ED途径通量和能量提供也是影响粪产碱杆菌凝胶多糖合成效率的关键因素。麦芽糖作为碳源底物过程中维持的较低的残留葡萄糖浓度解除了高葡萄糖浓度条件下对凝胶多糖合成的抑制,能够实现更高通量的ATP能量提供效率,更加促进了凝胶多糖合成通量。     

13CMFA过程中GC-MS分析菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度

基于13C标记的代谢通量分析(13CMFA)由于具有准确性和应用性已成为国际上代谢工程研究的热点,其中一个至关重要的问题就是分析菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。用含20%全标记葡萄糖（［U-13C］）和80%天然葡萄糖的合成培养基喂养维生素B12生产菌Pseudomonas denitrifican,然后在稳态条件下取20mg带13C标记菌体用1ml 6mol/L盐酸95℃水解24h得到带13C标记的菌体蛋白氨基酸;氨基酸经分离、浓缩、真空干燥、MBDSTFA衍生化后得到的TBDMS衍生物可以用气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析,最后分析质谱图得到15种菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。成功获得菌体蛋白氨基酸13C标记丰度信息的实验方法和样品处理技术,为13CMFA在国内进一步发展提供了参考意义。     

低场核磁共振技术快速检测小球藻油脂含量及其在高通量选育中的应用

为了建立一个高效的高产油微藻诱变育种流程,微藻中油脂含量快速和准确的测定在其中具有重要作用。在本研究中,首先利用低场核磁共振技术,建立了直接检测干藻粉和培养液中小球藻油脂含量的方法,其信号强度与细胞中油脂含量存在特异的线性关系,干藻粉和藻液中油脂含量与信号值拟合的R2均高于0.99,说明该方法用于小球藻油脂含量的检测是准确和可行的。同时该方法与传统油脂测量方法相比,具有快速、简便和准确等优点。但其通量不及尼罗红染色法,因此,我们开发了将尼罗红染色法用于初筛,低场核磁共振技术用于复筛的新型高通量藻种复合筛选方法,并将此筛选方法应用于一种异养高产油原壳小球藻的诱变育种过程中。首先从3 098株诱变藻种中初筛得到108株具有较高油脂含量的藻株,然后利用低场核磁共振技术复筛得到9株高产油性能的藻株,其中一株甘油三酯含量超过20%,比原始藻株提高1倍,培养168 h后培养液油脂浓度达到5 g/L,证明此诱变育种流程不仅提高了筛选的效率还可靠且可行。     

K~+/Na~+浓度比对罗汉果悬浮细胞生长和甜苷V合成的影响

本文研究了不同K~+/Na~+浓度比对罗汉果悬浮细胞生长和甜苷V合成的影响。结果表明,合适的K~+/Na~+浓度比促进细胞生长和甜苷V生物合成。当K~+/Na~+最佳浓度比为15:1时,罗汉果悬浮细胞内K~+浓度、K~+/Na~+、S_((K,Na))值均为最大,此时细胞利用K~+效率最高,细胞生长速率最快。此外,胞外有机酸和胞内氨基酸的变化表明此浓度比例下,细胞可能通过降低TCA循环代谢强度,以及增强EMP途径和MVA途径代谢强度,从而促进萜类化合物前体乙酰Co A向罗汉果甜苷V合成。     

粘细菌生物活性产物及其应用研究进展

粘细菌(myxobacteria)是一类具有多细胞群体行为特征的药源微生物类群。粘细菌能通过次级代谢产生大量结构新颖并具有生物活性的小分子天然产物,还能分泌种类、功能丰富多样的酶类。这些生物活性产物使粘细菌不仅具有重要的研究价值,还有广泛的应用前景。然而,资源挖掘困难、次级代谢产物得率低等制约因素的存在严重阻碍了粘细菌的研究和应用。本文主要对粘细菌的生物学特征、生物活性产物、生物合成调控及在医疗、农业和食品上的应用进行归纳总结,并结合已有成果对粘细菌研究存在的问题提出可能的对策和展望,为今后粘细菌的深入研究和资源开发利用提供参考。     

基于电容测定的罗汉果细胞超低温保藏快速方法

建立了一种基于活细胞电容值定量测定的植物细胞超低温保藏的快速评价方法,优化了罗汉果细胞超低温保藏方法。通过采用活细胞传感仪测定冻存后细胞的存活率并结合细胞生活力(细胞线粒体活性/TTC)对罗汉果细胞的低温保藏过程进行优化,确定了罗汉果细胞较为适宜的冷冻保护剂组分为基本培养基中添加10%的蔗糖和10%的DMSO。预处理剂的考察实验表明,采用0.2 mol/L蔗糖的预处理剂处理细胞时冻存后细胞存活率和细胞活力较高;采用0.2 mol/L蔗糖预处理剂处理细胞时,随着预处理时间的增加,细胞存活率先增加后降低,预处理时间为9 h时,细胞存活率和细胞活力最高。保藏后的细胞复苏实验结果表明:细胞存活率与采用活细胞电容值得到的细胞存活率具有很好的一致性,同时经过冻存的细胞复苏培养后,仍保留了原始细胞的形态和合成甜苷V的特性,说明该冻存方法适用于罗汉果细胞的超低温保藏。因此基于活细胞传感仪测得的电容值进行细胞冻存过程细胞活性的快速评价方法具有较好的可行性和可靠性。     

等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株

利福霉素SV毒性低、疗效高、抗菌谱广,主要由地中海拟无枝酸菌发酵生产,其发酵过程属于耗氧发酵,供氧直接影响产物形成。为减少发酵过程氧限制影响,进一步提高利福霉素发酵产量,通过构建定向氧限制模型,将常温常压等离子体诱变和无水亚硫酸钠氧限制筛选模型相结合,建立了利福霉素生产菌株24孔板快速培养的高通量筛选方法,高效选育出能够耐受低氧环境的利福霉素SV高产菌株NSMXG-M126,发酵代谢状态参数变化显示,该高产菌株具有更好的氧亲和力。同样的供氧条件下,与对照相比表现出较快的菌体生长速率和利福霉素SV的快速合成能力。在低供氧情况下发酵单位达到7839mg/L,较出发菌株提高48%,表明耐受低氧的突变菌株具有更高的利福霉素SV生产效率。