变性梯度凝胶电泳技术在微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳是不依赖于培养的、依据DNA分子的大小和所带电荷分析微生物多样性和动态变化的分子生物学技术,具有检测极限低、分析速度快及重复性好等优点。主要对变性梯度凝胶电泳原理、特点及其在微生物多样性应用方面进行综述。     

综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成

采用 PCR-DGGE (PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)方法研究了综合养殖池塘中三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鳊(Parabramis pekinensis)、银鲫(Carassius auratus gibelio)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)和鳙(Aristichthys nobilis)的肠道细菌组成,并分析了水体中的浮游细菌对鱼、蚌肠道细菌的影响。研究结果表明,三角帆蚌和混养鱼类肠道细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝细菌(Cyanobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)。其中,三角帆蚌肠道优势菌群为不动杆菌属(Acinetobacter)、志贺氏菌属(Shigella)和分枝杆菌属(Mycobacterium),草鱼肠道优势菌群为梭菌属(Clostridium),鳊肠道优势菌群为梭菌属和假单胞菌属(Pseudomonas),银鲫肠道优势菌群为不动杆菌属和志贺氏菌属,青鱼肠道优势菌群为梭菌属和不动杆菌属,鳙肠道优势菌群为不动杆菌属和弧菌属(Vibrio)。三角帆蚌与银鲫肠道细菌谱带相似性较高,草鱼与鳊肠道细菌谱带相似性较高,表明鱼类肠道细菌组成特点与食性存在一定的关系。水体浮游细菌优势菌群为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。三角帆蚌及鱼类肠道细菌群落与水体浮游细菌群落组成相似性较低,表明水体浮游细菌对三角帆蚌和鱼类肠道细菌优势菌群的影响有限。     

两种不同品系小鼠的人源菌群模型的建立与肠道菌群的比较

目的 比较KM(封闭群)和C57 BL/6J(近交系)两种小鼠人源菌群(Human flora-associated,HFA)模型的构建过程中小鼠肠道菌群的动态变化以及定植效果.方法 通过向无菌KM和C57BL/6J小鼠体内同时灌喂同一健康人的新鲜粪便,于灌喂后1、2和4周分别收集小鼠新鲜粪便.采用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术评价人肠道菌群在两种无菌小鼠体内的定植规律和定植效果.结果 两种小鼠的菌群条带数随时间的推移而明显增加,到第4周,两种品系的小鼠的菌群的一致性均略有增高,趋于稳定.UPGMA聚类分析显示,两种小鼠分别聚在了不同的聚类枝上;并且二者在Shannon-Wiener指数上差异有统计学意义(P＜0.05),在条带数S和与供体人的相似性差异有统计学意义(P＜0.01),且C57BL/6J HFA小鼠模型更接近人.结论 不同遗传背景的小鼠对肠道菌群具有选择性的定植效果,在多样性和与供体菌群的相似性方面,C57BL/6J HFA小鼠模型要优于KM HFA小鼠模型.     

酵母乙醇脱氢酶胍变性时的失活与去折叠的比较研究

应用荧光发射光谱,圆二色光谱,二阶导数光谱和紫外差吸收光谱等监测手段,研究了酵母乙醇脱氢酶在胍溶液中的去折叠。比较不同盐酸胍浓度下酵母乙醇脱氢酶的失活与构象变化,实验表明酶的失活先于构象变化：在低浓度胍溶液中,构象尚未发生明显变化时,酶活几乎已经完全丧失。由上述结果可见,含有辅基金属离子Ｚｎ~（２＋）酶的活性部位较酶分子的整体结构也具有柔性。     

热锻炼能提高菜豆细胞可溶性蛋白、SOD、膜ATP酶和质子泵在体外的热稳定性

以菜豆为实验材料,研究了蛋白质分子和生物膜在体外热稳定性的变化和原因。实验结果表明：热锻炼可增加细胞的耐热性,并赋予ＳＯＤ、膜ＡＴＰ酶和生物膜质子泵在体外的热稳定性;通过对可溶性蛋白热变性后的浊度分析和用ＡＮＳ荧光探针探测蛋白质的结构变化,发现蛋白热变性的原因是疏水区的暴露和分子相互团聚,~（３５）Ｓ－Ｍｅｔ标记分析和二维电泳谱揭示,热锻炼诱导合成的热激蛋白具有阻止蛋白质热变性和生物膜热破坏的功能。     

前路椎间盘减压融合与前路椎体次全切除减压融合治疗多节段颈椎病的疗效比较

目的:探索前路椎间盘减压融合与前路椎体次全切除减压治疗多节段颈椎病的疗效,为临床手术方式的选择提供依据。方法:收集我院骨科2008年6月到2014年6月收治的多节段颈椎病患者26例,按照患者手术方式分为研究组(13例)和对照组(13例),研究组给予前路椎间盘减压融合治疗,对照组给予前路椎体次全切除减压治疗,对比两组手术时间、术中出血量、术后住院时间,记录并分析两组术前和术后3月、6月、12个月JOA评分、颈椎总活动度、颈椎曲度、颈椎节段高度。结果:研究组手术时间、术中出血量低于对照组(P0.05);两组JOA评分术前、术后3月、6月、12个月逐渐升高(P0.05),术后12月组间差异有统计学意义(P0.05)。两组颈椎总活动度术前、术后3月、6月、12个月逐渐降低(P0.05),但是术后同时期组间差异无统计学意义(P0.05)。两组颈椎曲度与颈椎节段高度术后3月、6月、12个月差异有统计学意义(P0.05)。结论:前路椎间盘减压融合治疗多节段颈椎病较前路椎体次全切除减压治疗效果好,手术时间短、术中出血量少,并且颈椎曲度和节段高度恢复好。     

稀土尾矿土壤细菌群落结构对植被修复的响应

选用赣州-安远稀土弃废尾矿及其不同植被修复的堆浸田为研究对象,调查废弃尾矿及6种不同植被修复方案下土壤理化性质的变化,并利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)技术,分析土壤微生物群落结构对植被修复的响应。结果表明:与未修复尾矿土壤相比,经不同植被修复后的土壤理化性质均得到明显改良,其中土壤含水量、有机质含量均比未修复尾矿土壤增加2—3倍。微生物群落结构分析表明,植被修复后土壤微生物群落与废弃尾矿土壤微生物群落亲缘度仅为0.21,表明植被修复后,土壤微生物群落结构发生了明显变化,且微生物多样性、均匀度、丰富度与未修复尾矿土壤相比均有了明显的提高。而在不同植被修复方案中,以湿地松和山胡椒为优势群落的两种植被修复方案对土壤改良效果最为明显,这两种修复方案不仅能显著改善土壤的固水性、有机质含量,并且对微生物群落的改善作用也最为显著。典范对应分析表明,废弃尾矿土壤微生物群落结构受土壤p H影响最为显著,而植被修复后土壤微生物群落的环境影响因子则转变为含水量、有机质、有机碳及总磷含量。进一步揭示了微生物在植被修复过程中所起到的重要作用,并为矿山生态重建过程中的土壤改良工作提供了丰富的理论依据。     

口腔微生物多样性研究进展

口腔微生物多样性的改变是口腔常见感染性疾病的发病机制之一,随着分子生物学技术的普遍应用,研究者能够不通过纯培养技术即可对人类口腔不同生态系的微生物组成及变化进行研究。本文综述了当前口腔微生物多样性研究的常用方法及各自的特点,从而为口腔微生物生态方面的进一步深入研究提供参考。     

猪细小病毒NS1基因的原核表达及重组蛋白的复性

利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。     

生物造粒流化床污水处理反应器的微生物多样性

为了研究生物造粒流化床污水处理反应器颗粒污泥的微生物种群多样性,分别从生物造粒流化床10、60和110cm处取颗粒污泥,通过细胞裂解直接提取颗粒污泥细菌基因组DNA,PCR扩增后经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,获得微生物群落的DNA特征指纹图谱,对特征条带进行序列测定及序列同源性分析。16S rRNA序列分析表明,获得的18个OTUs均属于细菌域,其中61%属于变形菌,17%属于放线菌,11%属于低G C革兰氏阳性菌,11%属于其它未知细菌。