17β-雌二醇对不同性腺发育时期鲤鱼生长激素分泌的影响

目的　以不同性腺发育阶段的雌性鲤鱼为材料 ,采用脑垂体碎片离体灌流孵育的方法 ,研究 17β 雌二醇对由神经内分泌因子—促性腺激素释放激素和促甲状腺素释放激素诱导的生长激素分泌的调节作用的季节性变化特点。方法与结果　用 10 - 8mol L和 10 - 1 0 mol L 17β 雌二醇对鲤鱼脑垂体碎片进行 10～ 12h的过夜孵育后 ,性腺处于退化期和发育期的的鲤鱼脑垂体对浓度依次为 10 - 9,10 - 8和 10 - 7mol L的促性腺激素释放激素类似物的脉冲刺激的反应性显著大于对照组 ,但在成熟期 17β 雌二醇作用组的反应性与对照组无显著性差异 ;经过同样浓度的 17β 雌二醇预孵育后 ,鲤鱼脑垂体碎片对浓度依次为 10 - 1 0 ,3× 10 - 8和 10 - 7mol L的促甲状腺素释放激素脉冲刺激的反应性也表现出季节性差异 ,反应性的增强作用表现为 :成熟期 >发育期 >退化期。结论　性类固醇激素具有调节脑垂体对刺激生长激素分泌的神经内分泌因子的反应性的作用 ,这种调节作用与鱼体的性腺发育状态有关 ,具有季节性变化的特点     

花鳗鲡脑cDNA文库的构建及GnRH基因克隆与表达分析

以花鳗鲡脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建试剂盒构建cDNA文库。经检测,文库的滴度为4.3×106 cfu/mL,总容量为5.16×107 cfu/mL,阳性克隆率为99.6%,插入片段0.43－3.2kb之间,平均插入片段大小为1532bp。以文库为模板,克隆获得花鳗鲡两种类型的促性腺激素释放激素（mGnRH和cGnRH-II）cDNA序列。序列分析表明,花鳗鲡mGnRH cDNA开放阅读框(ORF)包含276个碱基,编码91个氨基酸,其中包括22个氨基酸的蛋白质前体信号肽（1－22位氨基酸）、mGnRH十肽（23－32位氨基酸）、一个三肽裂解位点（33－35位氨基酸）和56个氨基酸的GnRH相关肽（36－91位氨基酸）;花鳗鲡cGnRH-II cDNA开放阅读框包含264个碱基,编码87个氨基酸,其中包括24个氨基酸的蛋白质前体信号肽（1－24位氨基酸）、cGnRH-II十肽（25－34位氨基酸）、一个三肽裂解位点（34－36位氨基酸）和50个氨基酸的GnRH相关肽（37－87位氨基酸）。序列同源性分析表明,花鳗鲡mGnRH、cGnRH-II cDNA与日本鳗鲡之间的相似性率高达98%;与鲑形目、鲈形目、鲽形目鱼类的相似率为73%－78%;而与鲤形目鱼类的相似性相对较低（63%－67%）。采用RT-PCR 方法分析了两种GnRH基因在花鳗鲡雌雄个体中的表达,结果表明该两基因在雌雄个体的组织表达模式无明显差异;但mGnRH基因在雌雄个体内表达部位多于cGnRH-II的。     

鲤鱼肝胰脏cDNA 文库的表达序列标签分析及Lb-Fabp mRNA的特征

本文构建了鲤鱼肝胰脏cDNA 文库,共获得了1016条有效的表达序列标签。拼接组装成115 个contigs和282 个singletons。其中215个拼接序列在GenBank公共数据库中寻找到相对应的基因。对它们进行功能性分类和比较分析为鲤鱼肝胰脏的研究提供了基因表达信息的基础。文库中1016条表达序列标签有11条代表了鲤鱼肝基本型脂肪酸结合蛋白(Lb-FABP)。通过序列比较我们获得了两个具有相同开放阅读框长度的Lb-Fabp cDNAs。开放阅读框全长381bp,编码126个氨基酸。半定量RT-PCR结合Southern blot技术研究了Lb-Fabp mRNA 在成鱼不同组织以及早期发育不同时期的表达图式。结果表明,Lb-Fabp mRNA 在肝胰脏、中肠和后肠中表达量较高。同时在精巢和皮肤中有低水平的表达。脑、肌肉、卵巢、肾脏、脾脏、鳃和心脏等组织中其表达量更低。而在脂肪和前肠中则没有检测到Lb-FabpmRNA表达。Lb-Fabp mRNA 最早在胚体形成期检测到有低水平表达,随后的发育阶段中表达量逐渐升高。鲤鱼Lb-Fabp基因的表达图式提示在肝脏和肠等器官开始发育后,它可能在脂肪代谢中具有重要作用。     

肠溶微囊式重组鲤生长激素促生长剂的研制

采用草鱼生长激素夹心式酶联免疫吸附测定法和酶联免疫吸附受体测定法,研制肠溶微囊式重组鲤生长激素（rcGH)促生长剂,结果表明,肠溶树脂Ⅰ和Ⅱ溶解的pH阈值分别为6.0和6.6,当大于阈值时,肠溶微囊Ⅰ和Ⅱ内rcGH的释放率随pH值升高和时间延长而逐渐升高,直至rcGH完全释放,投喂胡子鲶（Clarias batra-chus)含肠溶微囊Ⅰ（内含rcGH0后,血清rcGH水平15h后开始升高,24h时达最大值,随后呈下降趋势,48h后血清中检测不到rcGH;而投喂含rcGH的药饵（1mgrcGH/g饵料）,6-60h在胡子鲶血清中均未检测到rcGH。说明肠溶微囊Ⅰ对rcGH起一定保护作用,肠溶微囊Ⅰ和Ⅱ具有抗酸肠溶胶囊的特点和作用。     

野生鲇鱼生长激素分泌的季节变化及其神经内分泌调控

采用离体垂体碎片灌流孵育系统 ,将处于性腺退化期野生鲇鱼垂体切成约 1mm3 的碎片 ,用M 199冲洗之后放入灌流柱的两层Cytodex -Ⅲ微载体之间 (温度为 19± 1℃ )。每 5分钟收集一管灌流液 ,- 2 5℃贮存待测GH。采用鲤鱼GH放射免疫测定方法 (cGHRIA)测定鲇鱼垂体碎片灌流液以及血清和垂体中的GH含量。结果表明 :促黄体素释放激素类似物 [desGly10 (D Ala6)LHRHethylamide ,LHRH A]不能显著刺激离体垂体碎片基础GH分泌 ,注射LHRH A后不能显著提高血清基础GH水平 ;注射DA能显著提高鲇鱼血清基础GH水平 ,APO能以剂量依赖方式显著刺激垂体碎片基础GH分泌。雌、雄鲇鱼血清GH水平在 6月达到峰值 ,垂体GH水平在 3月和 7月份各出现一个峰值 ,各个季节雌鱼垂体和血清GH水平均显著高于雄鱼。鲇鱼血清和垂体GH水平与生殖周期有密切联系。     

黑鲷生长激素放射受体分析法的建立及其受体组织的分布

利用黑棘鲷 (Acanthopagrusbutcheri)生长激素 (brGH )作为配体 ,建立了黑鲷 (Sparusmacrocephalus)生长激素受体放射受体分析法 (RadioreceptorAssay ,RRA)并分析其组织分布特征。在 2 5℃下 ,12 5I brGH与黑鲷肝细胞膜蛋白的特异性结合具有如下特点 :(1)时间依赖性　特异性结合达最大结合量一半的时间 (Ta1/ 2 )为 10 4h ,结合达到平衡状态需 2 0h ;激素 受体复合物的解离在 3h之内最快 ,2 4h后仅解离约40 % ,表明激素 -受体复合物的结合仅具部分可逆转性 ;(2 )可饱和性　12 5I brGH与黑鲷肝细胞膜蛋白的特异性结合随着膜蛋白浓度或12 5I brGH加入量的上升而呈逐渐上升并达到饱和状态的趋势 ;(3)可取代性　12 5I brGH与黑鲷肝细胞膜蛋白的特异性结合可被非标记brGH竞争性地取代 ,将特异性结合取代 5 0 % (ED50 )所需非标记brGH约为 3 8ng ,非标记重组金鱼生长激素 (rgfGH)及人生长激素 (hGH)对12 5IbrGH的竞争性取代能力明显较brGH低 ,而重组金鱼催乳素 (rgfPRL)、羊催乳素 (oPRL)在该系统中几乎无交叉反应。Scachard作图分析表明黑鲷肝细胞膜蛋白存在brGH单一的高亲和结合位点 ,Ka为 (3 49± 0 2 4)× 10 10 (mol/L) -1,Bmax为 146 8± 10 6fmol/mgprotein。结果表明 ,brGH与黑鲷肝细胞膜蛋白的     

诱导大鳍鱯和长吻鮠排卵过程中血清GTH水平的变化

繁殖期从嘉陵江收集性成熟的大鳍■ 和长吻 野生亲鱼,用Ｌｉｎｐｅ方法（即ＬＨＲＨ－Ａ加多巴胺Ｄ２受体拮抗剂地欧酮）或传统的ＬＨＲＨ—Ａ加脑垂体的方法进行催产,定时取血样,用放射免疫方法测定催产过程中血清ＧＴＨ水平的变化,进一步证实鲇形目鱼类ＧＴＨ的分泌受到下丘脑分泌的促性腺激素释放激素ＧｎＲＨ和多巴胺的双重调节;排卵和产卵也是以血清ＧＴＨ的急剧升高为先导的,而最终能否排卵还有赖于血清ＧＴＨ峰是否超过“排卵阈值”。尽管催产后的大鳍 和长吻 雄鱼血清ＧＴＨ水平也有一个高峰出现,但血清ＧＴＨ水平升高幅度都大大低于雌鱼,这种现象在硬骨鱼类可能具有普遍性。     

营养状况对幼年鲤鱼肝脏IGF-Ⅰ mRNA表达的影响

通过室外喂养观察3种营养状况对幼年鲤鱼生长、血清生长激素（GH）水平和组织胰岛素样生长因子－Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA表达的影响。一组鱼喂含40％酪蛋白的饵料（H组）,一组鱼喂含20％酪蛋白的饵料（L组）,饵料的总能量相同;另一组鱼先饥饿32天再投喂含40％酪蛋白的饵料。禁食后饥饿组鲤鱼体重和体长的生长受阻,在第16天饥饿组鱼血清GH水平明显升高,到第32天达到H组的4倍;而肝组织IGF－Ⅰ mRNA水平在第16天无明显下降,但是到第32天已降到不到H组的一半。鲤鱼其它组织饥饿32天未发现IGF－Ⅰ mRNA表达有明显变化。饥饿32天后开始投喂含40％酪蛋白的饵料,鲤鱼生长、肝组织IGF－Ⅰ mRNA的表达水平逐渐恢复,再投喂16天皆与H组无明显差异。再投喂过程中,GH水平也逐渐下降,第16天恢复正常。实验结果提示鲤鱼营养对肝组织IGF－Ⅰ mRNA的表达有调节作用。营养缺乏将导致鲤鱼肝组织IGF－Ⅰ mRNA的表达水平也相应恢复正常,从而导致鲤鱼生长恢复。同时,实验结果也提示,鲤鱼肝以外的组织IGF－Ⅰ mRNA表达不受营养调节。L组鲤鱼在喂养过程中,体重和体长的增长比H组低,但即使喂养40天,两组鱼体重和体长并无显著差异。两组鱼血清生长激素水平和各组织IGF－Ⅰ mRNA的表达水平到实验第32天也未发现有明显差异。推测在鲤鱼含正常能量和20％酪蛋白的饵料已能维持正常IGF－Ⅰ mRNA的表达。L组和H组鱼肝IGF－Ⅰ mRNA在喂养1个月后仍无显著差异也可能与实验时间较短有关。     

鱼类促性腺激素分泌的调节机理和高效新型鱼类催产剂

鱼类和其他脊椎动物一样,由下丘脑—脑垂体—性腺轴调节整个生殖活动,其中由脑垂体合成与分泌的促性腺激素(GtH)起着十分重要的作用。在一定环境条件影响和下丘脑的调控作用支配下,使脑垂体GtH的合成与释放活动增强,它作用于性腺组织而诱导性类固醇激素的产生,进而促使配子发育成熟和排精与排卵。因此,长期以来都是使用外源的GtH,如鲤鱼(或其他鱼类)脑垂体匀浆液或粗提的人体绒毛膜促性腺激素(HCG)作为鱼类人工繁殖的催产剂。这些催产剂虽有较好效果,但来源有限,成本高,亲鱼易产生抗药性,催产后死亡