大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。     

大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析

为了获得具有抗反馈抑制性质的大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH, d-3-phosphoglycerate dehydrogenase, EC 1.1.1.95）,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,用PCR突变法构建突变酶M1（缺失第410位氨基酸）、M2（缺失407~410位氨基酸）、M3（缺失337~410位氨基酸）。M0(野生型)及各突变型基因与pET22b(+)载体连接后,表达融合蛋白。在非变性条件下,由NTA-Ni镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白。酶活性测定结果表明,M1、M2蛋白酶均保持了原有的野生型磷酸甘油酸脱氢酶活性,且部分解除了终产物L-丝氨酸的反馈抑制作用;M3蛋白酶完全解除了终产物的反馈抑制作用,但酶本身的催化活性略有降低（为野生型的83%）。M0、M1、M2菌株PGDH与L-丝氨酸结合的Ki值分别约为7 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L,说明该酶C-末端1~4个氨基酸残基对L-丝氨酸和调控区的结合有重要影响。     

视黄醇结合蛋白研究

人视黄醇结合蛋白 (ｒｅｔｉｎｏｌｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏ ｔｅｉｎ ,ＲＢＰ)由 1 84个氨基酸组成 ,分子量 2 1ｋｄ ,是单链、疏水小分子结合蛋白 ,属于脂肪酸结合蛋白家族成员。ＲＢＰ在肝脏中合成 ,释放入血后与视黄醇 (ＲＯＨ)、甲状腺素运载蛋白(ＴＴＲ)以 1∶1∶1的比例形成三元复合物 ,是体内运送视黄醇至其特定靶组织的运载蛋白[1] 。ＲＢＰ的ｍＲＮＡ在肝中的含量最高。ＲＢＰ只有受到视黄醇的刺激才分泌 ,视黄醇的缺乏会阻断细胞内合成的ＲＢＰ由内质网到高尔基体的转运 ,从而影响ＲＢＰ的分泌 ,而且分泌入血的ＲＢＰ量也受到视黄醇…     

大肠杆菌苯丙氨酸合成途径关键酶基因pheA的克隆与表达

为了通过基因工程手段来增加苯丙氨酸的生物产量,利用ＰＣＲ方法从大肠杆菌中克隆了抗反馈抑制突变型及野生型的ｐｈｅＡ基因,进行了核苷酸序列分析,并利用高效的原核表达载体ＰＢＶ２２０对ｐｈｅＡ基因编码的突变型及野生型分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（ＣＭ／ＰＤ）进行了表达。序列分析表明突变型基因碱基第５８０位由Ｔ变为Ｃ,相应氨基酸由Ｖａｌ变为Ａｌａ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱扫描分析表明目的蛋白ＣＭ／ＰＤ的表达量占全菌体蛋白的４３％,占上清总蛋白的５７％。酶活性测定表明其ＣＭ和 ＰＤ活性分别提高了 １５．５和６．７倍,产酸量也有了一定的提高,为构建产苯丙氨酸的生物工程菌奠定了基础。     

条件性必需氨基酸在创伤愈合中的作用及其机制研究进展

研究表明 ,精氨酸 (Arg)、谷氨酰胺 (Gln)、牛磺酸 (Tau)等条件性必需氨基酸 (conditionallyessentialaminoacid ,CEAA)与创伤愈合关系密切。动物实验和临床研究资料显示 ,适量补充CEAA有利于创伤后机体的伤口愈合与功能恢复。其作用可能是通过对自由基代谢、免疫功能、NO的代谢等影响实现。     

条件必需氨基酸对放射损伤大鼠血浆蛋白的影响

观察条件必需氨基酸对放射损伤大鼠血浆蛋白的影响。以雄性Wistar大鼠 6 9只 ,普通饲料喂养 6天 ,随机分成A、B、C、D四组 ,A、B、C组各 2 0只、D组 9只。A、B、C三组动物均接受 6 .5Gy的γ线全身照射 ,D组动物不照射。照射后在A组饲料中添加 3%精氨酸 +5 %牛磺酸 +1%谷氨酰胺 ;B组饲料中添加与A组等氮量的甘氨酸 (10 .91% ) ;C组及D组仍喂普通饲料。照射后 7及 14天测血浆总蛋白、白蛋白、前白蛋白、纤维结合蛋白。结果显示A组在饲料摄入量、体重及血浆总蛋白、白蛋白、前白蛋白、纤维结合蛋白水平等方面均优于B组及C组。提示饲料中增加条件必需氨基酸含量可以改善进食 ,促进体重恢复及蛋白质合成 ,进而提高受照大鼠应激能力     

大肠杆菌ppsA和tktA基因的串联表达

ppsA和tktA是芳香族氨基酸生物合成中心途径的两个关键酶基因,在大肠杆菌中,ppsA基因编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A(PpsA),该酶催化丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸;tktA基因编码转酮酶A,该酶在磷酸戊糖途径中生成4-磷酸赤藓糖起主要作用。采用PCR方法从大肠杆菌K-12株中扩增到ppsA和tktA,并实现了两基因的高效表达,其中ppsA活性提高了10．8倍,tktA活性提高了3．9倍,当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌进行表达时,PpsA的活性变化较大(2．1～9．1倍),TktA的活性相对稳定(3．9～4．5倍),且这两个基因单独表达和串联表达都能使芳香族氨基酸生物合成共同途径中关键中间产物DAHP的产量提高,且串联表达比单独表达较高。     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造.首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢.然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈.与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍.pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L.为构建色氨酸高产菌奠定了基础.     

发酵液中色氨酸含量高通量快速测定

为了高通量筛选色氨酸工程菌,利用色氨酸与MAA在酸性条件下产生荧光物质(激发波长253 nm,发射波长450nm),荧光强度与色氨酸含量在一定范围内成正比的原理,建立了96孔微孔板中高通量测定发酵液色氨酸含量的方法。反应液80℃反应15 min后,测量荧光强度。线性范围为1 mg.L-1~100 mg.L-1,为大规模筛选色氨酸基因工程菌打下了基础。