CRISPR/dCas9在苜蓿中华根瘤菌中的建立与应用

本文探讨了CRISPR/dCas9系统对苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320内源hemE基因的弱化效果,以提高其维生素B_(12)的能力。实验首先验证了CRISPR/dCas9系统及CRISPR/dCas9系统不同N20靶向位点在S.meliloti 320中对外源基因gfp的弱化效果。结果显示,当添加诱导剂1%木糖时,单位OD荧光值降低为对照菌株的34.18%,当N20靶位靠近翻译起始位点时,对结构基因弱化效果明显。进一步探究CRISPR/dCas9对S.meliloti 320中内源的弱化效果发现,在加入终浓度为1%木糖诱导后,hemE基因的转录水平与对照相比下降了28.3%。将hemE基因弱化后的工程菌进行摇瓶发酵,其维生素B_(12)产量较对照株提高了9.86%。研究结果显示,hemE基因的弱化有效促进了代谢流引向维生素B_(12)合成,CRISPR/dCas9系统对S.meliloti 320内源结构基因具有较好的弱化效果。     

梗阻性低位直肠癌保肛手术可行性探讨

目的：探讨梗阻性低位直肠癌保肛治疗（直肠癌前切除术（dixon手术））的可行性及术后肠瘘的防治。方法：回顾性分析我科2009年1月．2012年1月梗阻性低位直肠癌的保肛治疗（dixon）24例手术患者（梗阻性保肛组）临床资料及非梗阻性低位直肠癌保肛治疗（dixon）的24例患者（非梗阻性保肛组）临床资料,比较梗阻性与非梗阻性低位肠梗阻保肛治疗的临床疗效,分析梗阻性低位肠梗阻保肛治疗的可行性。结果：梗阻性保肛组住院天数：11．9天,非梗阻性肠梗阻保肛组8．7天P〈0．05;梗阻性保肛纽发生肠瘘：4例（16．7％）,非梗阻性肠梗阻保肛组发生肠瘘：1例（4.2％）P〈0．05,经充分引流后肠痿愈合,无1人死亡,两组术后至出院期间死亡人数：0例;梗阻性保肛组肠功能恢复（以排气排便为指标）：5．1天,非梗阻性保肛组肠功能恢复：3．8天,P〈0．05;术后6个月腹泻便秘患者两组相同为24人;术后6个月梗阻性保肛组肿瘤复发6人（25％）,非梗阻性保肛组肿瘤复发5人（20．8％）,P〉0．05。结论：梗阻性低位肠梗阻保肛治疗住院期疗效较非梗阻性保肛组差,中远期疗效无明显差异。梗阻性低位直肠癌可行保肛治疗。     

湖南省健康人群血清总蛋白、白蛋白参考值调查

目的:本实验旨在建立湖南省健康人群血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)及A/G比值的参考值区间.方法:收集4543例湖南省城乡健康参考个体,采用全自动生化分析仪测定其血清TP、ALB值,并计算A/G比值,按不同年龄、性别、城乡进行分组统计学分析,建立适合湖南省人群TP、ALB及A/G比值的参考值.结果:湖南省健康人群参考区间为TP:66.51～82.85 g/L,ALB:43.09～50.19g/L,A/G比值为1.05～2.19;TP随年龄增大而稍有升高,中年达到高峰,后随年龄增大而降低,在各年龄组,女性均高于男性(P＜0.05),乡村地区TP值高于城市地区(P＜0.05);ALB随年龄增大稍有升高,在青壮年到达高峰而后下降,在儿童青少年、青壮年组血清ALB男性高于女性(P＜0.05),而在中年、老年组血清ALB无差别,乡村地区ALB值高于城市地区(P＜0.05);A/G比值随年龄的变化存在一定的差异性,A/G比值随年龄增大稍有增高,在青壮年组达到高峰而后下降,且在各年龄组男性高于女性(P＜00.05),城市地区A/G值高于乡村地区(P＜0.05);湖南省健康人群的TP、ALB与全国其他省市的TP、ALB存在差异.结论:湖南省健康人群TP、ALB、A/G比值参考区间与全国其它省份稍有差异,血清TP、Alb、A/G比值存在年龄、性别和地区差异性.     

发酵工业菌种的迭代创制

生物发酵是以微生物菌种为生物催化剂,以淀粉糖、生物质等可再生资源为原料发酵生产各种食品、化学品、燃料、材料等物质的生产过程,具有绿色、低碳和可持续等特征。我国拥有全球规模最大的生物发酵产业,尤其氨基酸、维生素等传统发酵产品占全球市场份额的60%–80%。发展生物发酵产业对于我国实现“碳中和、碳达峰”的战略目标和生物经济发展具有重要的意义。微生物工业菌种是生物发酵产业的核心,直接影响原料路线、产品种类和生产成本。创新发酵工业菌种,提升其原料转化利用效率,提高产物生产水平,拓展产品种类,是生物发酵产业高质量发展的关键。近年来,合成生物学、系统生物学等学科的发展,进一步加深了研究者对微生物底盘细胞生理代谢机制的理解,加速了基因编辑等菌种设计创制使能技术的发展,为发酵工业菌种改造提升提供了新动能。本文选取了具有代表性的大宗氨基酸、B族维生素、柠檬酸、燃料乙醇等发酵产业,从其工业微生物底盘的基础研究和技术开发角度,综述发酵工业菌种改造提升的最新进展,并展望人工智能、自动化与生命科学交叉融合将对工业菌种迭代产生的重要影响。     

枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望

枯草芽胞杆菌作为革兰阳性模式菌株是基础研究和工业应用的常用宿主细胞。介绍了枯草芽胞杆菌中蛋白合成和分泌过程中的重要步骤及重要调控位点。在枯草芽胞杆菌蛋白表达及分泌系统中,可以针对目标基因在体内的转录、翻译、折叠、转运和菌株改造等方面对表达分泌系统进行优化改良,针对不同的目标蛋白,可进行不同优化模块的组装和拼搭,以达到针对目标蛋白产物定制化地提高产量和分泌量的目的。在未来,随着基因编辑和合成生物技术的发展,菌株改良策略的不断优化,枯草芽胞杆菌将会在工业生产蛋白质制品领域发挥更大的应用价值。     

碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达

【背景】碱性蛋白酶是工业用酶中占比最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。近期研究发现碱性蛋白酶在生产生物活性肽方面有巨大潜力,这将进一步拓宽其在保健食品领域中的应用。【目的】利用枯草芽孢杆菌异源表达地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶SubC。【方法】通过筛选3种枯草芽孢杆菌宿主菌株(Bacillus subtilis 1A751、MA07、MA08)和6种信号肽(AmyE、AprE、NprE、Pel、YddT、YoqM),同时优化诱导剂浓度、发酵培养基和发酵时长,最终得到最优重组菌株MA08-AmyE-subCopt。【结果】重组菌株MA08-AmyE-subCopt的胞外酶活力为3.33×103 AU/mL,胞外蛋白分泌量为胞内可溶蛋白表达量的4倍,与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比,酶活提高了73.4%。【结论】异源碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中成功表达,为碱性蛋白酶SubC的表达和在保健食品领域的工业化应用提供了理论基础。     

通过信号肽筛选优化耐高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

以大肠-枯草穿梭载体p MA5质粒为基本骨架,以来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus NUB3621的耐高温α-淀粉酶基因为目标基因,利用POE-PCR法,成功构建针对淀粉酶的信号肽筛选载体。从枯草芽孢杆菌168基因组中扩增得到46个信号肽,利用POE-PCR法,使46个信号肽分别与线性化的筛选载体形成对应的multimer产物,直接转化枯草芽孢杆菌1A751,得到含不同信号肽的重组菌株。发酵结果显示,除了5个与淀粉酶适配性很低的信号肽,其它信号肽均有不同的引导淀粉酶细胞外分泌的能力,其中bgls引导淀粉酶细胞外分泌的能力最强,上清酶活的峰值达1 393.3 U/m L。     

二色补血草LbGRP基因的克隆及抗逆能力分析

富含甘氨酸RNA结合蛋白(Glycine-rich RNA-binding proteins, GRP)是植物中重要的转录后调控蛋白, 在植物的生长发育及对胁迫的抗性调控等过程中起重要作用。文章从二色补血草(Limonium bicolor (Bunge) O.) cDNA文库中克隆出了富含甘氨酸RNA结合蛋白基因(LbGRP)的全长cDNA序列(GenBank登录号: GQ398238)。为了研究LbGRP的抗逆功能, 将其构建到酵母表达载体pYES2中, 转化到酿酒酵母INVSc1菌株中, 获得重组酵母INVSc1(pYES2-LbGRP), 同时将转空pYES2质粒的酵母INVSc1(pYES2)作为对照。对重组酵母INVSc1 (pYES2-LbGRP)和对照INVSc1(pYES2)进行NaCl、KCl、NaHCO₃、Na₂CO₃、干旱和冷冻胁迫, 比较它们在不同胁迫下的存活率。结果表明, INVSc1(pYES2-LbGRP)在各种胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1(pYES2), 证明LbGRP基因具有抗NaCl、KCl、NaHCO₃、Na₂CO₃、干旱和冷冻等胁迫的能力, 推测该基因参与了二色补血草的抗逆调控过程。