两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响

背景:碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的:旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600中碱性蛋白酶AprE的产量。方法:以Bacillus subtilis WB600为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果:含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1. 23倍。双启动子重组菌B. subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1. 35倍,达到了6 125U/ml。结论:为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。     

MOFs固定5-羟甲基糠醛氧化酶及其催化活性的研究

固定化酶作为一种绿色高效的生物催化剂,其性能远超游离酶。目前酶的固定化技术适用范围仍然较小,酶的研究范围多停留在模型酶阶段,扩大固定化酶的研究范围具有十分重要的意义。金属有机骨架材料(MOFs)作为酶固定化的载体在近些年得到了广泛的探索,但是具有生物功能的酶-MOFs复合材料的许多特性仍有待挖掘。采用仿生矿化的合成方法将5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)固定到以沸石咪唑酯(ZIF-8)为代表的MOFs材料中,制备得到一种新的生物催化剂HMFO@ZIF-8,扫描电子显微镜表征其形态区别于经典的菱形十二面体。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,计算得到酶的固定化效率达到89. 0%。HMFO@ZIF-8催化5-羟甲基糠醛的转化率达到84. 3%,收率和选择性均高于游离酶。拓展了MOFs固定化酶的研究范围,为研究其他生物大分子复合材料的生物催化剂提供一定的借鉴意义。     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

过表达漆酶基因Lelcc1的香菇菌株构建及表型分析

真菌漆酶（laccase）是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。     

蝉棒束孢菌子实体对大鼠肾小管上皮细胞的影响

对蝉棒束孢菌子实体（0.75g/kg）重复灌胃SD雄性大鼠90d及恢复28d的早期肾损伤生物标记物肾损伤分子-1（KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）进行测定,评估蝉棒束孢菌子实体对肾小管上皮细胞的影响;研究不同剂量蝉棒束孢菌子实体（0.25g/kg、0.5g/kg、1.0g/kg）对肾小管上皮细胞增殖和增生能力的影响。给药30、60、90d及恢复28d时,SD大鼠血清中KIM-1浓度与对照组相比均无显著差异（P>0.05）,给药30d、60d时,SD大鼠血清中NGAL浓度与对照组相比均无显著差异（P>0.05）,给药90d及恢复28d时,SD大鼠血清中NGAL浓度低于对照组（P<0.05）,且给药90d组与对照组相比有显著性差异（P<0.01）;免疫组化检测增殖细胞核抗原法（PCNA）及四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）表明：与对照组相比,蝉棒束孢菌子实体能使肾小管上皮细胞增生能力增强,未导致肾小管上皮细胞凋亡。     

文蛤过氧化氢酶的生物信息学分析

基于NCBI数据库,对文蛤过氧化氢酶基因(MmeCAT)进行生物信息学分析,旨在为文蛤过氧化氢酶的结构与功能的研究提供理论基础。结果表明,该基因编码511个氨基酸。文蛤过氧化氢酶分子量为58 181.29 Da,分子式为C_(2588)H_(3928)O_(767)N_(730)S_(20),理论等电点为8.05,属亲水蛋白。带负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为63个,带正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)为65个。假设所有半胱氨酸全部形成胱氨酸,其消光系数为63 175 mol/L,相应的吸光度为1.086;假设所有的半胱氨酸均未形成胱氨酸时,消光系数为62 800 mol/L,相应的吸光度为1.079;其半衰期为30 h,脂肪族氨基酸指数为57.28,不稳定系数为27.77(40),可知文蛤过氧化氢酶为稳定蛋白质。亚细胞定位于过氧化物酶体,存在71个磷酸化位点和51个糖基化位点,无信号肽。二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,在物种进化上具有高度的保守性保守结构域预测表明,该基因编码蛋白可能属于典型单功能过氧化氢酶的第三分支。研究文蛤过氧化氢酶结构,能够为文蛤抗逆性品种选育提供理论基础。     

快速现场细胞学评价在经支气管针吸活检术诊断肺部良恶性疾病的临床应用

目的:超声引导下的经支气管针吸活检术(Endobronchial ultrasound guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)是临床上广泛开展的经支气管的微创介入技术,在EBUS-TBNA过程中,快速现场细胞学评价(Cytologicalrapidon-siteevaluation,C-ROSE)是切实可行的临床辅助技术。本研究探讨C-ROSE在EBUS-TBNA对肺部疾病诊断的细胞学特点及诊断价值。方法:对41例经胸部计算机断层扫描(Computed tomography,CT)发现存在纵隔和(或)肺门病灶(包括肿大的淋巴结/肿块)而行EBUS-TBNA及C-ROSE患者进行回顾性分析。结果:C-ROSE镜下的细胞学具有明显特点,对肺部良恶性疾病的穿刺成功率无差异,诊断率分别为90.48%和66.67%(P0.05),且C-ROSE可完全排除恶性疾病的诊断,二组并发症发生率分别为9.52%和6.67%(P0.05)。结论:C-ROSE在EBUS-TBNA中对肺部良恶性病变均具有诊断价值,可以提高穿刺成功率及诊断率、减少并发症,值得在临床医疗介入中心推广。     

普罗布考联合胰激肽原酶对老年糖尿病周围神经病变患者氧化应激反应及血清NSE水平的影响

目的:探讨普罗布考联合胰激肽原酶对老年糖尿病周围神经病变患者氧化应激反应及血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平的影响。方法:选择2015年8月至2017年8月我院接诊的94例老年糖尿病周围神经病变患者作为本研究对象,通过随机数表法将其分为观察组(n=47)和对照组(n=47)。对照组在常规治疗基础上给予胰激肽原酶治疗,观察组在对照组基础上联合普罗布考治疗,两组均连续治疗12周。比较两组治疗后的临床疗效、治疗前后运动传导速度(MNCV)、感觉传导速度(SNCV)、多伦多临床评分系统(TCSS)评分、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及NSE水平的变化和不良反应的发生情况。结果:治疗后,观察组临床疗效总有效率为93.62%(44/47),明显高于对照组[70.21%(33/47)](P0.05);两组正中神经、腓总神经MNCV、SNCV较治疗前均显著延长(P0.05),且观察组正中神经、腓总神经MNCV、SNCV均明显高于对照组(P0.05);两组TCSS评分各内容和总分、血清MDA、NSE水平较治疗前均显著降低(P0.05),且观察组TCSS评分中症状评分、反射评分、感觉评分和总分及、血清MDA、NSE水平均明显低于对照组(P0.05);两组血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平较治疗前均显著升高(P0.05),且观察组血清SOD、CAT、GSH-Px水平均明显比对照组高(P0.05)。两组治疗期间不良反应总发生率分别为10.64%(5/47)、4.26%(2/47),组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:普罗布考联合胰激肽原酶治疗老年糖尿病周围神经病变患者的效果显著优于单用胰激肽原酶治疗,可更有效改善神经病变程度,其机制可能和缓解氧化应激反应、降低血清NSE水平有关。     

急性心肌梗死合并肺部感染患者多药耐药菌分布特征及心肌酶谱指标与炎性因子的关系分析

目的:分析急性心肌梗死合并肺部感染患者多药耐药菌分布特征及炎性因子与心肌酶谱指标的关系。方法:选择2015年2月~2018年10月期间中国人民解放军联勤保障部队第940医院收治的67例急性心肌梗死合并肺部感染患者作为感染组,选取同期收治的60例单纯急性心肌梗死患者作为未感染组,分析感染组多药耐药菌的分布及其耐药性,比较两组炎性因子与心肌酶谱指标水平,采用Pearson相关性分析感染组患者炎性因子与心肌酶谱指标的相关性。结果:67例患者痰培养标本中共分离出136株病原菌,其中有64株属于多药耐药菌,多药耐药菌中革兰阴性菌38株,占59.37%,革兰阳性菌26株,占40.63%。其中主要革兰阴性菌对哌拉西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、美罗培南、亚胺培南等较为敏感,主要革兰阳性菌对替考拉宁、万古霉素、利福平等较为敏感。感染组患者白细胞介素-6(IL-6)、乳酸脱氢酶(LDH)、促血管生成素-2(Ang-2)、肌酸激酶(CK)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平均高于未感染组患者(P0.05)。经Pearson相关性分析可得,感染组患者血清IL-6、Ang-2、TNF-α水平与AST、LDH、CK、CK-MB水平均呈正相关(P0.05)。结论:急性心肌梗死合并肺部感染患者心肌酶谱与炎性因子水平关系密切,有助于判断患者病情严重程度,且急性心肌梗死合并肺部感染患者多药耐药现象较为严重,临床应针对病原菌合理选取抗菌药物。