烟碱降解细菌Ochrobactrum intermedium DN2生长培养基及培养条件的优化研究

在烟碱生物降解的研究和实际应用中,需要在较短的时间内获得大量O.intermediumDN2菌体。为了提高菌株DN2的菌体浓度,缩短其培养时间,本研究采用PlackettBurman设计对影响O.intermediumDN2生长的内在和外在相关因素进行了评价。结果表明,影响菌株DN2生长的显著因素有胰蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、初始pH值、温度、装液量和培养时间。在此基础上,采用响应曲面法分别对该菌生长培养基的组成和培养条件进行优化,得到最佳培养基组成为(g/L):胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl5.00、MgSO₄·7H₂O3.71,pH值7.23;最佳培养条件为温度32℃、转速120r/min、装液量88ml/250ml三角瓶、培养时间34h。5L发酵罐验证实验表明,菌株DN2达到最大生长量的时间为36h,与预测值34h基本一致,比优化前缩短约12h;最大菌体浓度为6.49×10₉cfu/ml,与预测值6.73×10₉cfu/ml接近,比优化前高近一个数量级。     

抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单抗制备及应用

本研究旨在制备抗人脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2)单克隆抗体,对单抗进行初步评价,采用免疫层析方法学,建立一种可在社区医疗机构应用的Lp-PLA2快速检测方法。首先从NCBI获得人Lp-PLA2全长基因序列构建表达载体,在CHO-K1细胞中表达Lp-PLA2重组蛋白。以获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术筛选杂交瘤细胞,小鼠腹水诱生单克隆抗体。通过SDS-PAGE、ELISA等方法评价抗体性能。利用双抗夹心法制备Lp-PLA2量子点荧光免疫层析检测试剂,并使用便携式检测仪器评估试剂性能。制备并筛选得到亲和力达到1×10~(–8)的配对单克隆抗体PLA1与PLA5,抗体亚类为IgG1,能特异性识别血液中Lp-PLA2蛋白。自制Lp-PLA2量子点荧光免疫检测试剂可检测线性范围为20–2000ng/mL,与进口试剂的检测相关系数R达到0.99。综上,本研究制备得到一对高亲和力、高特异性的抗人Lp-PLA2单克隆抗体,并建立了Lp-PLA2免疫层析检测方法,该方法检测准确、操作简便,适合Lp-PLA2检测应用于社区医疗机构,为居民心血管健康管理提供了新途径。     

海洋链霉菌GB-2发酵产物的抗细菌活性及性质研究

从连云港海域潮间带采集的样品中筛选得到一株产高活性抗细菌物质的链霉菌GB-2。该菌的发酵产物对蜡样芽孢杆菌AS1.1846、金黄色葡萄球菌ATCC25923及6株耐药性金黄色葡萄球菌等11株革兰氏阳性菌,大肠杆菌AS1.487、荧光假单胞菌AS1.1802等4株革兰氏阴性菌有显著拮抗作用。纸层析对抗细菌物质分析结果表明,菌株GB-2所产抗细菌物质是中性的水溶性物质,其产生与海水的存在有显著相关性。发酵液稳定性研究表明,该物质在121℃,pH1和pH12条件下抑菌活性均不变;紫外线照射也不影响其抑细菌活性。显示菌株GB-2产物在生防、食品及医药方面潜在的应用价值。     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobial lipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨.结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(Porcine Kidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(Median Toxicosis Dose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57 mg/L、18.9 mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(Cytopathic Effects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制.由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究.     

预测微生物学的研究进展

简要介绍了预测微生物学模型的2个类型(品质预测模型和安全评估模型),特定腐败菌在微生物预测中的特殊作用,可追溯技术、温度综合函数和生物指示器等新技术在微生物预测中的应用,以及国外的预测模型库和国内的研究现状,展望了预测微生物学未来的发展趋势。     

普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。     

Bacillus sp. fmbJ224发酵产新型抗菌肽培养基的优化研究

采用Plackett-Burman设计(Plackett_Burman Design,PB) 法,对影响Bacillussp.fmbJ224产新型抗菌肽的17个因素进行了筛选。结果表明：影响该菌发酵产新型抗菌肽的主要培养基成分为葡萄糖、NH₄NO₃、谷氨酸、CaCl₂、MnSO₄。在此基础上,再采用响应曲面法(Response Surface Methodology RSM)对其5个显著因子的最佳水平范围进行研究。通过对二次多项回归方程求解得知,在上述自变量分别为葡萄糖8.13g/L、NH₄NO₃6.14g/L、谷氨酸4.2g/L、CaCl₂ 3.98mg/L、MnSO₄4.87mg/L时,新型抗菌肽的产量从1304.21μg/mL提高到了1487.58μg/mL。     

枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定

[目的]在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础.[方法]本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性.[结果]克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性.[结论]Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能.     

Plantaricin 163对热杀索丝菌的抗菌活性及其作用机制

【背景】热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)为鲫鱼在4°C贮藏过程中的主要腐败菌,Plantaricin 163是由植物乳杆菌产生的一种新型广谱细菌素,能明显延长鲫鱼的贮藏期。【目的】研究Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌活性和作用机制。【方法】通过测定最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration)和杀菌动力学了解Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌效果,并从电导率的变化、核酸和蛋白的泄露、流式细胞实验、扫描电镜和透射电镜观察等4个方面探讨Plantaricin 163对热杀索丝菌的作用机制。【结果】Plantaricin 163对热杀索丝菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,优于Nisin的作用效果,作用方式为杀菌模式,6 h内能完全杀死热杀索丝菌。Plantaricin163能够通过增加热杀索丝菌细胞膜的通透性,增加胞外电导率,进而破坏细胞膜完整性,导致内容物泄漏,并影响细胞的外部形态和内部结构,从而导致菌体细胞瓦解死亡。【结论】Plantaricin 163可以破坏热杀索丝菌的细胞膜和内部结构,发挥抗菌活性。     

翅鳞伞深层发酵胞外多糖优化研究

采用PlackettBurman设计(PlackettBurman Design, PB)对影响翅鳞伞［ Pholiota squarrosa (Pers. Ex Fr.) Quel.］ AS 5245菌株发酵产糖的内在和外在相关因素进行了筛选,所选取的20个相关因素为葡萄糖、果糖、麦芽糖、酵母膏、胰蛋白胨、KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、FeSO₄、MgSO₄、MnCl₂、ZnCl₂、FeCl₃、CuSO₄·5H₂O、维生素B1、起始pH、发酵温度、时间和装液量。在此基础上,再采用响应曲面法(Response Surface Methodology,RSM)对影响发酵产糖的内在关键影响因素酵母膏、果糖、MgSO₄、麦芽糖、ZnCl₂和发酵基质起始pH值的最佳水平范围作了进一步的研究与探讨,通过对二次多项回归方程求解得知,在上述自变量分别为6.0g/L、11.5g/L、0.5g/L、9.6g/L、38.6mg/L和5.3时,胞外多糖最大预测值为876.32μg/mL发酵醪,此预测可信度不仅被统计分析所验证,也实践所证实。