稻瘟菌糖蛋白激发子(CSBI)的纯化及其鉴定

稻瘟菌（Magnaporthe grisea）ZC1l3菌株97-151a菌丝经离心、超滤、Sephacryl S-100凝胶柱、DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析,纯化获得糖蛋白激发子CSBI。CSBI经SDS-PAGE后银染显示单一条带,糖,蛋白比例约为9．32。CSBI对非亲和性互作水稻叶片中过氧化物酶的诱导显著高于亲和性互作水稻（P〈0．05）。经N端氨基酸同源序列比对表明,CSBI与MG07877．4推测蛋白的同源性最高。经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定也表明CSBI是该推测蛋白。     

Proteomic Analysis of Rice Plasma Membrane-associated Proteins in Response to Chitooligosaccharide Elicitors

Chitooligomers or chitooligosaccharides （COS） are elicitors that bind to the plasma membrane （PM） and elicit various defense responses. However, the PM-bound proteins involved in elicitor-mediated plant defense responses still remain widely unknown. In order to get more information about PM proteins involved in rice defense responses, we conducted PM proteomic analysis of the rice suspension cells elicited by COS. A total of 14 up- or downregulated protein spots were observed on 2-D gels of PM fractions at 12 h and 24 h after COS incubation. Of them, eight protein spots were successfully identified by MS （mass spectrography） and predicted to be associated to the PM and function in plant defense, including a putative PKN/PRK1 protein kinase, a putative pyruvate kinase isozyme G, a putative zinc finger protein, a putative MAR-binding protein MFP1, and a putative calcium-dependent protein kinase. Interestingly, a COS-induced pM5-like protein was identified for the first time in plants, which is a transmembrane nodal modulator in transforming growth factor-β（TGFβ） signaling in vertebrates. We also identified two members of a rice polyprotein family, which were up-regulated by COS. Our study would provide a starting point for functionality of PM proteins in the rice basal defense.     

诱导水稻抗褐飞虱的化学激发子筛选

【目的】化学激发子具有毒性低、不易产生抗药性等特点,因此开发基于化学激发子的害虫防控技术,能够降低农药的使用量,促进农业生产的可持续发展。本研究旨在筛选能够诱导水稻产生对褐飞虱Nilaparvata lugens抗性的化学激发子。【方法】将茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、水杨酸甲酯(MeSA)、油菜素内酯(BR)、苯甲酸苄酯(BB)、独脚金内酯(SLs)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、草酸钠(SO)、硅酸钾(PS)和叶枯唑(Bis)12种化合物以根吸或叶鞘涂抹处理水稻,测定这些化合物处理水稻后褐飞虱的卵孵化率和24 h总产卵量。【结果】12种候选化合物中,仅茉莉酸甲酯、油菜素内酯和苯甲酸苄酯对褐飞虱卵孵化率和24 h总产卵量有显著影响。5 mg/L MeJA根吸处理水稻使褐飞虱的卵孵化率显著降低(达58.8%,降低了20.1%),而0.5 mg MeJA叶鞘涂抹处理水稻同时降低了褐飞虱的卵孵化率(达53.3%,降低了35.4%)和24 h总产卵量(达203.5粒/株,降低了15.6%),且其涂抹的浓度越高,褐飞虱的卵孵化率和24 h总产卵量越低。5 mg/L BR根吸处理水稻可以显著降低褐飞虱的卵孵化率(达59.5%,降低了22.1%),但是不影响褐飞虱的24 h总产卵量;褐飞虱的卵孵化率随BR处理浓度增高而降低,其浓度为20 mg/L时,褐飞虱的卵孵化率下降了41.8%。5 mg/L BB根吸处理水稻可以显著降低褐飞虱的24 h总产卵量(达100.3粒/株,降低了26.2%)。体外试验结果表明,MeJA和BR处理对褐飞虱卵孵化率无明显影响,说明两者对褐飞虱卵无直接毒害作用。【结论】化合物茉莉酸甲酯、油菜素内酯和苯甲酸苄酯可以提高水稻对褐飞虱的抗性,其中茉莉酸甲酯和油菜素内酯具有化学激发子的作用。     

激发子诱发的小麦叶肉细胞原生质体[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流

以小麦叶肉细胞原生质体-激发子互作为研究体系,借助共聚焦激光扫描显微镜观察结合药物学试验,对激发子刺激后不同抗叶锈性小麦品种原生质体[Ca2+]cyt的动态变化和[Ca2+]cyt升高的钙来源进行了研究。结果表明：抗叶锈小麦品种‘洛夫林10’的原生质体在激发子处理后,[Ca2+]cyt明显升高,随后有所下降,但在试验检测时间范围内仍保持较高浓度水平;而感病品种‘郑州5389’经激发子处理后,[Ca2+]cyt只发生轻微的波动。使用质膜钙通道抑制剂抑制胞外钙离子流入胞内,再经激发子处理,原生质体[Ca2+]cyt虽也有升高,但升高幅度大大降低。这一结果表明,激发子刺激诱发的[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

激发子PebC1原核表达蛋白的生物活性分析

将激发子PebC1基因在大肠杆菌中进行表达,重组蛋白可以明显促进植物生长,诱导植物产生抗旱性和抗病性.用不同浓度的重组表达蛋白PebC1处理番茄,其幼苗的株高分别增加了24.56％-48.34％;同时诱导了番茄对灰霉病的系统抗性,番茄的病叶率和病情指数均明显下降,诱抗效果达到34.06％-52.44％.小麦经重组表达蛋白PebC1处理后,叶片的抗衰度和幼苗存活率也明显增加,抗旱综合系数从15.28提高到了64.88.     

木霉菌在玉米病害生物防治中的作用机制及应用

目前,世界上共有分属于10个属（Trichoderma,Gliocladium,Chaetomium,Bacillus,Burkhoderia,Streptomyces and Pseudomonas,Pantoea,Enterobacter,Macrobacterium）中的微生物被试验用于玉米病害的生物防治,其中细菌14种,真菌17种,放线菌1种。国际上由木霉菌开发的生物杀菌剂和生物肥料有50余种,其中以哈茨木霉T22菌株开发的产品最为著名。目前在我国也开发出了4种木霉菌剂型（可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂和种衣剂）,正式登记的木霉菌杀菌剂有7种,其中6种为可湿粉剂,1种为水分散粒剂,主要登记用于防治番茄、观赏百合、黄瓜的立枯病、猝倒病、根腐病、灰霉病、霜霉病以及小麦的纹枯病,但尚无木霉菌生物农药被登记用于防治玉米病害。以木霉菌为主要成分登记的菌肥产品有11种,其中在玉米上应用的有2种。由课题组研制的木霉菌颗粒剂和种衣剂通过土壤穴施和种子包衣可有效防治玉米茎腐病和纹枯病,其中木霉菌颗粒剂防效达65%-87%。近期研制的木霉菌可湿性粉剂对玉米小斑病的防效达50%-60%。国际上已鉴定出多种可诱导玉米获得系统抗性的木霉菌源激发子,其中包括Sm1、纤维素酶、疏水蛋白和Avr4 /Avr9等效应因子。本课题组近年鉴定出Thc6（锌指蛋白类转录因子）、PAF-AH和Thph1/Thph2的编码产物在系统诱导以JA/ET信号调控的玉米抗弯孢菌叶斑病中具有重要作用,符合植物免疫MAMPs模式,为全面认识木霉菌诱导免疫机理提供了重要理论依据。木霉菌诱导玉米从根至叶片的防御反应系统传导机制还需深入研究。     

绿木霉SM1蛋白诱导拟南芥防御反应以及激发活性氧途径研究

SM1蛋白是由绿木霉Trichoderma virens产生的一种富含半胱氨酸的小蛋白,能够作为激发子激发植物防御反应。研究了SM1蛋白对拟南芥Arabidopsis thaliana生长及诱导抗性的作用。结果表明高浓度（>10μg/mL）SM1蛋白液抑制拟南芥的生长,低浓度SM1蛋白液则不影响生长;SM1能诱导拟南芥对细菌性叶斑病Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000的抗性,引起拟南芥叶片过氧化氢的积累。SM1蛋白处理后,拟南芥叶片中植物防御反应相关基因PDF1.2、LOX2和活性氧酶基因 SOD、POD等表达显著上升,说明SM1在激活植物的JA/ET和ROS途径中发挥着重要作用。研究为进一步研究SM1诱导植物抗性的机理提供了基础。     

小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中Ca2+和 NO的动态变化及其相互作用

以感染叶锈菌的小麦(Triticum aestivum)叶片细胞间隙液IWF-260作为激发子, 刺激小麦品种洛夫林10和郑州5389的悬浮细胞, 探讨由激发子引发悬浮细胞过敏性反应中Ca²⁺和NO的变化及相互作用。以荧光分子探针Fluo-3AM和DAF-FM DA分别对细胞内Ca²⁺和NO进行标记, 利用激光共聚焦扫描显微镜对其动态变化进行实时监测, 通过药物学实验对Ca²⁺和NO的产生机制及其可能存在的相互关系进行探讨。结果表明, 2个小麦品种悬浮细胞的[Ca²⁺]_cyt水平对激发子刺激的反应表现出明显的差异, 对叶锈菌小种表现不亲和的洛夫林10悬浮细胞分别在激发子刺激后330秒和700秒出现2个钙峰; 而对该小种表现亲和的郑州5389悬浮细胞在激发子刺激后[Ca²⁺]_cyt水平稍有波动但变化不明显。药物学实验证明, [Ca²⁺]_cyt的升高依赖于胞外钙离子内流, 钙离子与激发子刺激诱发的过敏性防卫反应紧密相关。同样, 在激发子刺激后, 洛夫林10悬浮细胞出现1个NO峰, 而郑州5389悬浮细胞胞质NO变化不明显。药物学实验初步证明, NO的产生与胞外钙离子内流密切相关。由此推测, 在小麦悬浮细胞应答激发子刺激诱发的过敏性反应中, NO可能在钙的下游发挥作用。