产碱菌（Alcaligenes sp.）119转化苯丙酮酸形成L—苯丙氨酸的研究

从土壤中分离到一株产碱菌１１９,能将苯丙酮酸一步转化成Ｌ－苯丙氨酸。酶反应的最适ｐＨ为８．５,该酶在ｐＨ８－９之间稳定,最适反应温度为３７－４５℃,金属离子Ｆｅ＾２＋,Ｍｎ＾２ｎ等对酶有不同程度的抑制作用。该菌株培养在由葡萄糖,蛋白胨、牛肉膏等组成的培养基中,可获得最高转化率。Ｌ－天冬氨酸为酶反应的最佳氨基供体。当苯丙酮酸浓度为０．２ｍｏｌ／Ｌ时,细胞在３７℃下反应１６小时,可产Ｌ－苯丙氨酸３０．     

应用电激法在大肠杆菌中导入外源性DNA

本文报道用国产基因导科脉冲仪(LN－101型),采用高压脉冲电场,将质粒DNA和噬菌体DNA成功地转化或转导人大肠杆菌。该电场单次电压脉冲范围1．Okv一2．5kv(初电场强度2,8kV／cm一16kV／cm)、电容范围5—20μF,用质粒pUC18和受体菌株DH5α,获得10　9－10　10转化子／μgDNA。电场强度、电容及脉冲时间等不同的因素影响转化效率。转化率与DNA的强度呈线性关系,与受体细胞密度成正比。 DNA和受体菌混合物在电激前,后的孵育时间,对转化效率影响不明显。用噬菌体M13mp 19 RF及受体菌株JMl09,同样可获得较高的转化效率。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

基因重组与外源铁离子对大肠杆菌合成血红素的影响

【背景】大肠杆菌通过C5途径合成卟啉及血红素,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是C5途径中关键的前体物质,血红素由原卟啉IX (protoporphyrin IX, PPIX)螯合一个铁离子所形成,目前5-ALA与PPIX的外泌对卟啉的积累和血红素合成的影响尚不清楚。【目的】构建5-ALA外泌蛋白基因rhtA和卟啉外泌蛋白基因tolC双缺失的大肠杆菌以积累卟啉,同时外源添加铁离子,并过表达亚铁螯合酶基因hemH及参与铁摄取的基因efeB,促进卟啉向血红素的转化。【方法】通过Red同源重组敲除大肠杆菌BL21(DE3)的rhtA和tolC,并外源添加不同浓度的FeSO₄及Fe₂(SO₄)₃,同时构建重组质粒pEHE过表达hemH和efeB,检测卟啉和血红素含量,分析卟啉向血红素的转化。【结果】敲除rhtA和tolC对菌体生长无显著影响,与野生菌WT相比,敲除菌株WT-RT的卟啉含量增加,血红素合成略有提升。外源添加100μmol/L Fe²⁺     

植物质体基因工程调控元件研究进展

随着植物合成生物学的发展,质体逐渐成为许多具有商业价值的次生代谢产物和治疗性蛋白异源生产的理想平台。与核基因工程相比,质体基因工程在外源基因高效表达和生物安全性等方面具有其独特优势。然而,外源基因在质体系统中的组成型表达或对植物生长不利,因此需进一步挖掘、设计调控元件实现对外源基因的精准调控。本文概述了质体基因工程调控元件的研究进展,内容包括操纵子设计与优化思路、多基因共表达调控策略及新型表达调控元件的挖掘等,为植物合成生物学的发展提供参考。     

南苜蓿组织和原生质体培养及转化试验

主要探讨南苜宿子叶和下胚轴外植体,子叶原生岳体培养中的器官发生及遗传转化。南苜蓿子叶和下胚细外植体培养在附加１ＡＡ０．５－１ｍｇ／Ｌ和细胞分裂素（ＢＡ或ＺＴ）０．５－２ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上,在有当照的条件下诱导形成不定芽,进而再生成完整植株。子叶原生质体培养在附加２,４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ和ＫＴ０．２ｍｇ／Ｌ的Ｂ５液体培养基中,细胞分裂频率可达３０－４１％,原生质全来源的愈伤组织在ＭＳＢ培养基（Ｍ     

植物多基因干扰载体体系构建与效用分析

多数重要的功能基因属于多基因家族,这些家族成员间存在功能冗余,高效的多基因干扰体系对研究多基因家族成员的生物学功能及其分子调控机制具有重要意义。对pCAMBIA1301载体改造,构建了适用于植物的多基因干扰体系pCAMBIA1301m和pCAMBIA1301s。使用该多基因干扰体系构建了四基因的干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4,4个目标基因为来源于番茄PP2C家族A组的PP2C1、PP2C2、PP2C3和PP2C4,并通过遗传转化导入番茄,用GUS染色和PCR检测转基因阳性植株,再利用RT-qPCR技术检测T₁和T₂代转基因植株中目标基因的干扰效率,用T₂代种子分析转基因番茄对ABA敏感性。结果表明,应用该干扰体系成功获得了四基因干扰的转基因植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。在转基因番茄中4个目标基因的表达量显著低于野生型,其干扰效率均高于70%,转基因番茄种子萌发具有强烈的ABA不敏感性。多基因干扰体系能高效地同时沉默多个目标基因。     

培养条件下枯落物分解过程中微生物残体对土壤有机碳形成的贡献

采用黄土丘陵区多年生C3草本植物长芒草为对象,模拟“枯落物-土壤”转换界面,进行了为期512 d的室内分解试验,对枯落物分解过程中界面土层微生物残体和土壤碳组分动态进行了研究。结果表明：土壤微生物残体的形成在分解早期和中期由真菌主导,而在晚期由细菌主导。真菌残体碳对矿物结合态有机碳的贡献率(38.7%～75.8%)明显高于细菌(9.2%～22.5%),是细菌残体贡献率的3～4倍。土壤有机碳含量在枯落物分解过程中呈下降趋势。植物碳源的输入调动了微生物对土壤碳组分的利用。颗粒态有机碳分解早期和晚期持续下降,成为土壤有机碳含量减少的直接原因;而微生物残体碳和矿质结合态有机碳的波动变化对土壤有机碳含量的降低只起到间接作用。一次性外源添加枯落物引起的土壤微生物残体碳的增加并没有直接贡献土壤有机碳的积累。     

大丽轮枝菌（Verticillim dahliae）突变体库的构建与分析

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13 030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1 528 782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因（VDAG＿04017）。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。