汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2腺病毒载体的表达及免疫分析

为了研究利用腺病毒载体表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2的可行性及免疫原性。通过克隆76-118株G1、G2基因至腺病毒表达载体pAdTrackCMV,得到阳性克隆padTrackCMV-G1、G2。PmeI线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共转化BJ5183宿主菌,经同源重组后得到重组病毒rAdeasy-G1、rAdeasy-G2。重组病毒经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,使重组病毒得到扩增。将重组病毒免疫Balb／c小鼠,并通过ELISA和间接免疫荧光对免疫小鼠血清进行了分析。结果表明,rAdeasy—G1组六只免疫小鼠、rAdeasy—G2组4只免疫小鼠均产生了能与汉滩病毒抗原发生反应的特异抗体。该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的汉坦病毒工程疫苗奠定了基础。     

我国SEO型汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

为获得SEO型病毒基因组更为详尽的资料,也为局部暴发的原因提供科学的资料,我们采用病毒分离、McAbs分型.RT-PCR扩增及核苷酸序列测定的方法,在国内首次测出我国SEO型病毒较为完整的全S片段,并与76-118、Seoul、SRll株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较,分别为64.2%、91.8%、96.8%及80.5%、95.4%、97.3%.表明病毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因.     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

汉滩病毒糖蛋白G1G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

以汉滩病毒７６／１１８株Ｍ、Ｓ片段分别插入转南粒ＰＪＳＢ１１７５的Ｐ１１和Ｐ７．５启动子下游,构建成重组质粒ＰＪＳＢ１１７．５Ｓ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染针重组质粒分别与痘苗病毒天坛株ＴＫｖｖ和表达Ｓ片的重线痘苗病毒ＶＪＳＡ１１７５Ｓ进行共转染,免疫酶斑和蓝白筛法筛选并纯化,得到了重组病毒ＶＪＳＢ１１Ｍ５Ｓ。Ｂｕｄｒ的选择压力试验表明,外源基因确定插入在ＴＫ基因区;ＰＣＲ及打点杂交证实了两个片     

应用反转录-套式PCR方法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病毒特异性RNA

采用５′端生物素标记汉滩病毒特异性寡核苷酸探针,结合磁性分离技术和异硫氰酸胍－酚一步法（胍酚法）提取病毒ＲＮＡ,进行反转录－套式ＰＣＲ,检测肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人血清样本,胍酚法能检测血清中至少几个ＰＦＵ病毒的ＲＮＡ,比磁珠法敏感１０倍,整个检测过程在５小时完成。应用该方法对１３７份汉滩型和汉城型ＨＦＲＳ病人血清进行检测分型,总阳性率达６０．５０％。其中,病程在７日以内（急性期）的病人血清仍能检测到２２．７３％阳性率。扩增产物经打点杂交检测证实为特异性扩增,并能准确分型。与空斑减少中和试验（ＰＲＮＴ）分型的符合率为１００％。对２０份正常人及２４份非ＨＦＲＳ患者血清进行ＰＣＲ扩增,结果均为阴性。将全部试剂做成试剂盒,为基层单位早期诊断肾综合征出血热病人提供了操作简便、特异、敏感、快速、直接的诊断方法。     

原位杂交定位实验乳鼠各脏器中流行性出血热病毒RNA

用~8H-dTTP和生物素-11-dUTP标记流行性出血热病毒(EHFV)R22株M片段R3 cDNA制备探针,采用原位杂交法对EHFV感染的Ba1b/C乳鼠各脏器进行了病毒RNA定位。实验结果,病毒RNA主要定位于脑、肾、肾上腺、肝、心脏。在脑,病毒主要侵犯大脑皮质、海马回神经元,可见阳性颗粒或阳性     

流行性出血热病毒灭活后免疫原性的初步研究

本文用较高感染滴度的Vero-E6细胞和小白鼠乳鼠脑病毒,经56℃1小时加温或1:2,000福尔马林灭活后,免疫成年小白鼠、黑线姬鼠和长爪沙鼠。结果Vero-E6细胞培养的病毒均未使动物产生可测出的抗体,而小白鼠乳鼠脑病毒则获得良好的抗体阳转率(92％)。同时证明,热灭活较福尔马林灭活者好,加佐剂较不加佐剂好。     

我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分布研究

为了搞清全国汉坦病毒的基因型和亚型的分布情况,广泛收集了全国各地汉坦病毒毒株、阳性病人血清和阳性鼠肺,并应用RT-PCR的方法,应用汉坦病毒型特异性引物,对这些不同来源的阳性标本中汉坦病毒型特异性M和S片段进行扩增和测序,并与其它已知病毒序列进行比较,以明确其型别和亚型及其在全国的分布情况.结果表明:我国HFRS各疫区仍然为HTNV和SEOV两型病毒,但亚型分布差异较大,其中HTNV可分为9个亚型,SEOV则有4～6个亚型.Q32株的部分M和S片段分属于H9和H2亚型,是一个基因重排病毒,而Nc167株在系统发生上与其它HTNV明显不同,比较核苷酸序列发现,其M片段与其它HTNV的同源性在71.3%～76.7%之间,S片段与其它HTNV的同源性只有52.3%～57.8%,可能是一个新型病毒.     

汉滩病毒A9株强毒和弱毒克隆M基因片段G1糖蛋白编码区核苷酸序列的分析比较

采用逆转录－ＰＣＲ方法,用３对引物分３个片段扩增强毒克隆（Ａ９ｖ）及弱毒克隆（Ａ３％）的Ｍ基因片段ｃＤＮＡ,并克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测定了Ａ３９ｓ、Ａ９ｖ病毒Ｇ１糖蛋白编码区的全序列,发现二者均由１９７８个核苷酸组成,比７６／１１８株少６个核苷酸,并发现Ａ３９ｓ在Ｇ１编码区有３３个碱基及８个氨基酸与Ａ９ｖ不同。进一步与７６／１１８、ＨＶ１１４的相关序列比较,发现Ｇ１编码区的第６０６、６１４位氨基酸的变异同Ａ３９ｓ病毒的减毒有一定相关。从Ａ３９ｓ、Ａ９ｖ、７６／１１８及ＨＶ１１４４株病毒Ｇ１糖蛋白编码区推导的氨基酸序列亲疏水性资料显示,在位于Ｇ１糖蛋白Ｃ末端的最大亲水区域的６００～６２０位氨基酸区域,弱毒株Ａ３９ｓ同强毒株Ａ９ｖ、７６／１１８、ＨＶ１１４的亲水性有明显不同,而这一差异又主要由第６１４位氨基酸的变异所引起。因此推测,Ｇ１糖蛋白Ｃ端亲水区域同汉滩病毒毒力相关,而第６１４位的精氨酸被谷氨酰胺取代,同Ａ３９ｓ病毒毒力的减弱可能有关。