质粒DNA物理形态和其它因素对获得可育转基因小麦的影响

本工作分析了不同形态质粒DNA和未成熟胚高渗透压处理对基因枪小麦转化体系的适用性.高渗处理对瞬间表达和转基因小麦的再生均有明显的促进作用.轰击之前对质粒DNA进行变性处理导致瞬间表达反应大幅度下降,但稳定转化频率(指从100个轰击未成熟胚得到的再生可育转基因植株数)与双链DNA相差不大.使用单链质粒DNA、线性双链质粒DNA和环状双链质粒DNA均可以得到转基因小麦植株.迄今已得到26个不同的转基因冬小麦株系和4个不同的转基因春小麦株系.这些转基因小麦大多数已产生种子,几个春小麦株系已获第二代种子.     

红豆草抗羟脯氨酸变异系原生质体培养后愈伤组织的抗性特征

通过NaN3诱变得到的红豆草抗羟脯氨酸（Hyp）变异系,在酶液中游离原生质体进行培养,获得再生植株。在含不同浓度NaCl、羟脯氨酸或PEG的MS培养基上,原生质体来源抗性意伤组织中的游离脯氨酸含量在1周之内均急剧增加,随后开始下降,3周后接近正常水平。随着胁迫程度的提高,抗性愈伤组织中游离脯氨酸含量呈递增趋势,生长速度呈递减趋势。     

沙蒿组织培养植株再生

沙蒿种子灭菌后,接入ＭＳ无激素培养基得到无菌苗。取２０天无菌苗子叶切成小块,接入含２,４－Ｄ的ＭＳ培养基诱导愈伤组织,并在同样培养基上进行继代增殖。愈伤组织在含６－ＢＡ,ＮＡＡ的ＭＳ培养基上分化得到芽。将芽转至含ＩＡＡ的１／２ＭＳ培养基上形成根,从而得到完整植株。同时对影响沙蒿组织培养的一些因素进行了研究。结果表明培养基中２,４－Ｄ含量（０．５－２ｍｇ／Ｌ）越高,沙蒿愈伤组织生长越快,而褐化发生时     

高羊茅FaChit1基因组DNA的克隆及其拷贝数的验定

以获得的高羊茅FaChit1基因cDNA设计引物扩增其基因组DNA,序列比对发现该基因内不存在内含子.进一步采用染色体步移方法分离FaChit1基因上游的一段935 bp启动子序列以及下游的一段470 bp 3′非翻译区序列发现,在该启动子区域内不仅含有保守的TATA盒和CAAT盒,而且包含多个潜在的与胁迫应答有关的顺式调控元件,表明该启动子可能是1个多胁迫诱导型启动子.此外,在FaChit1 3′非翻译区含有真核生物基因中高度保守的特征序列.Southern杂交结果表明,FaChit1在高羊茅基因组中有2个拷贝.     

几种匍匐翦股颖成熟胚愈伤组织诱导及植株再生

利用成熟种子作为外植体,分析了2,4-D对匍匐翦股颖胚性愈伤组织诱导与植株再生体系的影响,并对体细胞胚的发生过程进行了观察.实验结果表明,在2.0 mg/L 2,4-D 0.1 mg/L 6-BA时胚性愈伤组织的诱导频率最高.随着2,4-D浓度的增加,愈伤组织的诱导和分化能力明显下降.在再生过程中采用1.0 mg/L的6-BA达到了比较好的效果,愈伤组织的再生频率大部分在90%以上.同时发现适当提高肌醇浓度可以使苗长得较为粗壮.在实验中发现匍匐翦股颖的体细胞胚发生过程为球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚.     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、1mg/L KT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株（转化频率为4.17%）。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na⁺及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K⁺的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

利用转基因烟草确定AtELHYPRP2蛋白对赤霉菌的抗性及其亚细胞定位特征

采用遗传转化技术获得了整合有拟南芥AtELHYPRP2(EARLI1-LIKE HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN 2,AT4G12500)基因的转基因烟草株系,研究了该基因编码蛋白对真菌病原体赤霉菌的抗性及其亚细胞定位特征。以拟南芥Col-0生态型基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增AtELHYPRP2基因编码序列,经限制性酶切后连接至pCAMBIA1302载体,构建产生pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP融合表达载体。进一步采用农杆菌LBA4404转化烟草叶片外植体,筛选得到转基因烟草植株。RT-PCR、Western blotting印迹分析结果显示,AtELHYPRP2基因在转化体中可以有效表达。激光共聚焦显微观察发现AtELHYPRP2-GFP融合蛋白产生的绿色荧光与碘化丙啶染色后产生的红色荧光能够重合,说明AtELHYPRP2蛋白定位于细胞表面。真菌侵染实验结果显示,组成性表达AtELHYPRP2基因能够增强烟草对赤霉菌的抗性,被侵染部位有明显的H2O2积累。转基因烟草植株中PR1基因的本底表达水平比野生型高,PR1和PR5基因的系统表达水平比野生型高,说明AtELHYPRP2基因可能在SAR反应中具有一定的作用。     

多年生黑麦草成熟胚再生体系的建立及基因枪转化

目的:建立以多年生黑麦草成熟胚为起始材料的再生体系,用于基因枪转化。方法:多年生黑麦草成熟种子在附加 5mg L 2,4 D的MS培养基上诱导愈伤组织,转至新继代培养基上产生胚性愈伤组织。分化培养基为无激素MS培养基。再生植株在培养基成分减半的无激素MS培养基生根,之后移栽至土壤。基于这一再生体系,用含有水稻几丁质酶基因RC2 4的质粒pARN6和含有草丁膦乙酰转移酶基因Bar的质粒pDB1,通过基因枪轰击胚性愈伤组织。用附加PPT的继代培养基进行转化植株的抗性筛选。结果:共获得 2 4 3株再生植株。通过PCR进行检测,获得1 8株整合有RC2 4基因的植株,1 5株整合有Bar基因的植株,同时转入 2个基因的植株 2株。     

豆科植物的体细胞杂交

包括许多重要粮食和饲料作物在内的豆科植物的体细胞杂交研究已有20多年历史。早在70年代，Kao等[15]即利用豌豆、大豆原生质体与其它植物原生质体进行融合，观察到可以分裂的大豆（＋）豌豆、玉米（＋）大豆、小麦（＋）大豆异核体，大麦和大豆融合细胞最后形成细胞团，同时指出核融合发生在融合后的第一次分裂过程中。1974年，Kartha等[16]将大豆（Glycinemax）悬浮培养细胞原生质体与油菜原生质体融合，也得到细胞团。1976年，Constabel等[10]得到了大豆悬浮培养细胞与豌豆、Viciahajastana（一种野豌豆）、烟草、番红花叶肉细胞原生质…     

小麦总RNA的快速提取

Rneasy Kits用于从小量小麦中分离总RNA。它为同时和多次制备各种生物样品提供了一种快捷而简便的方法-整个过程可以在30分钟内完成。而且Rneasy方法中不再涉及使用有毒物质,如酚类、氯仿等。通过此方法纯化的RNA可用于各种标准的下游技术,如RT-PCR、polyA^ RNA选择、差异显示技术、Northern点杂交和狭线杂交、引物延伸、cDNA合成、陈列表达分析和表达芯片分析等。使用这个盒子,我们多次成功的进行了小麦总RNA的分离,其中的三次在本文中进行了分析。OD260nm/OD280nm介于1.7-2.0之间,OD260nm/OD230nm大于2.0.说明RNA纯度很高,未被蛋白质、苯酚等物质污染。