人胎盘中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的提取

胶原蛋白是重要的细胞外基质成分,约占人体蛋白总量的1/3,目前已确定的胶原至少有12种类型,各型胶原都具有一定的分子构型、基因定位及组织分布特点。胶原的提取与纯化是进行胶原免疫组织化学研究的必要步骤。本文参照国外有关文献并作适当改进,成功地从人胎盘中提取了Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白。     

流行性出血热病人尸检材料中的病毒包涵体

应用抗流行性出血热病毒多克隆及单克隆抗体结合敏感的方法在尸检组织切片上进行了免疫细胞化学染色,多克隆抗体可清楚地显示出尸检组织中病毒抗原阳性的包涵体结构。依光镜下染色的形态特点不同,可将包涵体分为四个类型即小泡型、大泡型、多泡型和实心型。单克隆抗体染色进一步证实,实心型及空泡型包涵体呈“N”抗原阳性,少数组织中空泡状包涵体也呈“G2”抗原阳性。病毒包涵体的出现可作为该病毒在人体细胞内感染及复制的形态学证据。     

人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达

利用RT-PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆牛蛙核糖核酸酶(RC—RNase)基因并进行序列测定;将人源化抗肝癌单链抗体(scFv)基因与RC—RNase基因相连接,制备scFv—RC—RNase融合基因表达质粒,转化大肠杆菌B121(DE3),用IPTG诱导进行表达。以SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行分析鉴定。序列分析表明,扩增出的RC—RNase基因片断大小约为405bpc,经SDS—PAGE和免疫印迹分析显示,scFv—RC—RNase融合基因表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子质量约为38000的一条新生蛋白带,与预期结果相符。融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的18．5％,主要以包涵体形式存在。表明成功地构建了抗肝癌scFv—RC—RNase融合基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

汉滩病毒诱导小鼠骨髓瘤SP2/0细胞凋亡的初步研究

为研究汉滩病毒对肿瘤细胞的诱导凋亡作用,以一定量病毒悬液感染体外培养的SP2/0细胞,接种后定时间将细胞消化甩片行Gimsa染色观察凋亡细胞核的变化,制细胞悬液以流式细胞仪测细胞周期,并用免疫组化的方法检测凋亡分子Fas和FasL的表达.结果示经病毒诱导后细胞出现生长特性及形态学变化,Giemsa染色观察到典型凋亡细胞;流式细胞仪显示有凋亡峰出现;免疫组化检测出感染后SP2/0细胞中Fas和FasL表达明显升高.该结果表明汉滩病毒可诱导体外培养SP2/0细胞凋亡,其发生可能与凋亡分子Fas和FasL有关.     

多重PAP及多重PAP结合ABC免疫细胞化学方法的建立、敏感性分析与应用

作者在传统的 PAP 及 ABC 染色方法的基础上,通过重复使用桥抗及 PAP 的次数或重复使用生物素化桥抗及 PAP 和 ABC 的次数,使 PAP 与 ABC 方法成功地结合,增加连接于抗原部位的酶分子数,建立起两种敏感的免疫细胞化学方法。染色结果经显微分光光度图象分析,方差分析,回归分析及染色效果的直接观察表明,重复染色可增加阳性强度,扩大阳性染色范围,提高信噪比,从而提高方法的敏感性,以生物素化桥抗取代非生物素化桥抗,将 ABC 引入到多重 PAP 方法中,可使方法的敏感性进一步提高。该方法结合单克隆抗体及多克隆抗体成功地检测出用传统双PAP 及 ABC 难以或不能检测出的常规福尔马林固定石蜡包埋的肾综合征出血热尸检组织中的病毒抗原及石蜡包埋肿瘤活检组织中的桥粒抗原。     

细胞中流行性出血热(EHF)病毒抗原部分弥散及其原位检测

用流行性出血热病人尸检及活检材料。以不同固定液、不同免疫细胞化学方法等对细胞中的EHFV抗原进行了检测。用目前我国自产的六种单克隆抗体(McAbs)单用或混用,只能定位出固定及时,近期保存标本中的抗原。在长期保存的尸检标本上及延期固定的活检标本上,光镜及电镜下均可见抗原有明确的弥散现象。用多克隆抗体(PcAb)配合高级敏感的免疫细胞化学方法可显示保存近三十年的陈旧尸检蜡块切片中残存的部分抗原。不同的固定剂、固定时间、免疫细胞化学方法、清除内源酶的时间及病期都对定位EHFV抗原有一定影响。     

原位杂交定位实验乳鼠各脏器中流行性出血热病毒RNA

用~8H-dTTP和生物素-11-dUTP标记流行性出血热病毒(EHFV)R22株M片段R3 cDNA制备探针,采用原位杂交法对EHFV感染的Ba1b/C乳鼠各脏器进行了病毒RNA定位。实验结果,病毒RNA主要定位于脑、肾、肾上腺、肝、心脏。在脑,病毒主要侵犯大脑皮质、海马回神经元,可见阳性颗粒或阳性     

乙型肝炎、肝硬变中一种小多角细胞的观察

我们曾在２６例肝硬变标本中发现一种小多角细胞－－肝小多角细胞（ＳＰＬＣ）,但其性质和来源仍不清。本研究在２６０例乙型肝炎、肝硬变组织中对ＳＰＬＣ的有无及其增生程度进行了观察,结果表明,急性肝炎中无ＳＰＬＣ,３７％的慢性迁延性肝炎、６４％的慢性活动性肝炎及６７％的肝硬变标本中均能见到ＳＰＬＣ,而且其数目随慢性肝脏病变的进展而逐渐增加。应用多种抗体进行的免疫组织化学染色表明,它们全为细胞角蛋白（ＣＫ）１８阳性,显示其上皮性质;界板附近的ＳＰＬＣ呈ＣＫ１９和Ｓ－１００蛋白阳性,提示它们具有增生胆小管上皮的某些表型;部分ＳＰＬＣＨＢｓＡＧ阳性,提示它们又有肝细胞的某些特点;多数ＳＰＬＣ表达胰岛素样生长因子（ＩＧＦⅡ）—一种癌胚性强致裂原,表明它们是一种幼稚细胞。我们认为,ＳＰＬＣ是一类兼有增生胆小管上皮和肝细胞性质的新型肝脏细胞,具有干细胞的性质,可能是上皮性于细胞向成熟肝细胞分化过程中的中间形态,其增生反映了非界板性肝细胞的大量损失。     

汉坦病毒感染诱导乳鼠脑神经细胞表达热休克蛋白70

生后2～3天的昆明乳鼠,每只腹腔接种0.05mL100个半数致死量的陈株汉坦病毒,于接种后不同时间点处死动物,取其脑组织常规固定,石蜡包埋制备5μm连续组织切片,用免疫组化法检测组织中的病毒抗原及热休克蛋白70的表达,用共聚焦显微镜观察二者之间的关系。结果发现,感染了病毒的组织能够稳定地检测到热休克蛋白70的表达,而病毒阴性的组织则检测不到热休克蛋白70的表达,且二者有共定位关系,其分布与组织病变一致。这与在病毒感染的VeroE6细胞及EHF病人尸检组织中得到的结果一致,说明病毒感染可诱导热休克蛋白70的表达,后者可能具有保护组织避免或减轻损伤的作用。     

Hsp70-NP融合蛋白增强诱导HTNV NP特异性CTL的实验研究

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验。此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并用RT-PCR,Westernblots以及免疫荧光染色证实N蛋白在胞浆中表达。淋巴细胞增殖实验表明,Hsp70-NP,NP组小鼠脾淋巴细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组的增殖指数明显高于NP免疫组。细胞毒实验结果表明,LDH的释放具有效应细胞依赖性,Hsp70-NP,NP免疫组脾淋巴细胞均可以特异性杀伤靶细胞B16-N,而Hsp70-NP免疫组的杀伤率显著高于NP免疫组。实验结果显示,Hsp70可以增强NP诱导产生特异性CTL的能力。本研究结果为进一步设计基于NP的合成肽疫苗或基因疫苗提供了重要实验依据。