Tet-on和Cre/loxP系统双重调控HCV NS5B真核表达载体的设计与构建

目的:构建可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCVNS5B真核表达载体,为建立可严格调控HCV NS5B蛋白表达的转基因小鼠奠定基础.方法:以真核表达载体pBI-3为载体构建骨架,在其启动子下游依次插入luc报告基因、BGH pA和NS5B基因片段,并分别在luc报告基因上游和BGH pA尾下游引入一个loxP位点.结果:成功构建了可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCV NS5B真核表达载体pBI-3/luc-BGH pA-NS5B.结论:pBI-3/luc-BGH pA-NS5B真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV NS5B蛋白表达转基因小鼠的建立打下了良好的基础.     

慢性扁桃体炎、咽炎与细菌L型的关系及慢性咽炎发生原因的探讨

应用病原微生物培养、组织切片革兰氏染色Ｌ型检查和Ｌ型抗体免疫组化染色的方法,对１７５例标本（慢性扁桃体炎１１１例、慢性咽炎６４例）进行细菌Ｌ型检测。结果显示,培养的１１４例标本中有８６例培养出细菌Ｌ型,其阳性率为７５．４％;组织切片革兰氏染色有１４６例（８３．４％）查见细菌Ｌ型,两者阳性率之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）;免疫组化染色金葡菌ＣｏｗａｎⅠ株Ｌ型抗休标记阳性率为５８．３％。提示,细菌Ｌ型感染与慢性扁桃体炎、慢性咽炎关系密切。并认为,细菌Ｌ型感染是扁桃体切除后发生慢性咽炎的原因之一。     

沉积硅藻揭示的历史时期水生植被信息以梁子湖为例

水生植被是浅水湖泊生态系统最重要的生态特征之一, 了解其群落历史演化特征, 对生态退化湖泊的修复有着重要指导意义。研究选择长江中下游地区代表性草型湖泊梁子湖, 基于梁子湖沉积岩芯210Pb/137Cs测年、沉积硅藻序列和梁子湖长期水生植被监测记录, 探讨利用沉积硅藻记录来重建该湖历史时期水生植被演替特征的可行性。研究结果表明: 梁子湖沉积硅藻记录对历史时期水生植被的演替有较好的反映; 基于此, 对梁子湖过去近200年的水生植被覆盖度进行了重建; 与湖泊流域历史环境信息的对比分析表明洪水是影响该湖水生植被发育的一个重要因素。研究结果证实了在浅水湖泊中, 沉积硅藻可揭示历史水生植被的信息, 并为该湖的水生植被保护提供科学依据, 同时对该区富营养湖泊的生态修复有重要的指导价值。       

重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的cDNA,PCR产物连接入原核表达载体pET-22或pET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(plySs),获得重组工程菌BL21(DE3)-pET-24-eh,BL21(DE3)-pET-22-eh,BL21(plySs)-pET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-pET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD₆₀₀=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。     

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的：获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白（E2 661）编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果：成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论：可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,进行相互作用分子的筛选研究。     

女儿寨小流域3种植被类型林冠层对降水再分配研究

对女儿寨小流域3种植被类型林冠层林冠层对降水再分配过程进行了研究。研究结果表明: 观测期内降雨量达到1971.80 mm, 降雨次数为83次。不同植被类型杜仲林、枫樟混交林和马尾松林的林冠截留量分别为289.75 mm、358.78 mm和351.46 mm, 林冠截留率分别为14.69%、18.19%和18.79%。随着降雨量增大, 不同植被类型的林冠截留量也增大, 二者呈正相关关系。混交林的穿透雨量和林冠截留量大于纯林, 而纯林的树干茎流量大于混交林; 不同植被类型林冠层对降雨的分配表现为穿透雨最多, 其次是林冠截留, 树干茎流最小。     

细菌L型常见的一种多形性—类白喉样形态

细菌Ｌ型是细菌的细胞壁缺陷型。因为缺壁故形态多变，常呈现大小不等的球状、膨大的杆状、细长的丝状。本室曾多次从临床标本分离，发现细菌Ｌ型有呈类白喉样形态，易误认为类白喉杆菌，现以两个临床实例检查加以说明。病例１患者，男，３０岁，慢性颈淋巴结炎，取咽拭子...     

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。     

蓝光对浮游状态和生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌作用

目的：探讨450 nm-470 nm可见光（蓝光）是否具有杀灭浮游状态和生物膜内铜绿假单胞菌的作用。方法：分别采用不同能量密度的蓝光照射浮游状态铜绿假单胞菌,与红光对照组、空白对照组相比,将照射后细菌采用平板涂板法评价蓝光杀菌效果;制作铜绿假单胞菌生物膜模型,16 J/cm2能量密度蓝光照射后通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察生物膜内细菌存活情况以及生物膜结构变化。结果：与空白对照组相比,2 J/cm2及以上能量密度组蓝光照射后,细菌数目明显减少,杀菌率明显增加（P〈0.05）,并呈剂量效应关系;16 J/cm2能量密度光照后生物膜内细菌死亡数较空白对照组明显增加且生物膜结构变稀疏。结论：450 nm-470 nm可见光（蓝光）具有高效杀灭浮游状态和生物膜内铜绿假单胞菌的作用。     

Bcl-2、C-erbB-2基因与卵巢肿瘤的关系

目的探讨bcl-2凋亡抑制基因、c-erbB-2癌基因和细菌L型感染在卵巢肿瘤中的表达及其意义.方法采用免疫组化和革兰染色方法,检测了101例卵巢肿瘤中的bcl-2、c-erbB-2基因的表达,以及细菌L型的检出率.结果恶性肿瘤中Bcl-2、C-erbB-2蛋白产物的表达率明显高于良性肿瘤(P＜0.01),Bcl-2、C-erbB-2蛋白在卵巢恶性肿瘤中临床分期Ⅲ、Ⅳ期中的阳性表达率,明显高于Ⅰ、Ⅱ期,病理分级Ⅲ级的表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ级(P＜0.01).细菌L型的检出率与腹腔淋巴结有转移、有腹水者比无转移及无腹水者差异有显著性(P＜0.05),而细菌L型的检出率与肿瘤的类型、临床分期、病理分级差异无显著性(P＞0.05).结论bcl-2、c-erbB-2基因在卵巢肿瘤中有不同程度异常表达,两种基因的表达与肿瘤的临床分期及病理分级有明显相关性(P＜0.01).L型感染极有可能导致基因的变异,因此L型感染可能成为诱发肿瘤形成的因素之一.bcl-2凋亡抑制基因、c-erbB-2癌基因的过度表达和变异,以及细菌L型感染可能相互协同在卵巢肿瘤发生和发展过程中起重要作用.