大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析*

为研究细菌的耐盐机理 ,根据细菌中存在的Na⁺/H⁺反向运输体 (nhaA)的基因序列 ,采用PCR扩增的方法 ,从大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α中克隆获得了11kb的DNA片段 ,经过核酸序列分析 ,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法 ,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在 ,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^{+相似文献}   

系统生物学——生命科学的新领域

系统生物学是继基因组学、蛋白质组学之后一门新兴的生物学交叉学科,代表21世纪生物学的未来.最近,系统生物学研究机构纷纷成立.在研究上,了解一个复杂的生物系统需要整合实验和计算方法.基因组学和蛋白质组学中的高通量方法为系统生物学发展提供了大量的数据.计算生物学通过数据处理、模型构建和理论分析,成为系统生物学发展的一个必不可缺、强有力的工具.在应用上,系统生物学代表新一代医药开发和疾病防治的方向.     

ARF-GEF基因家族的研究进展

ARF-GEFs是小G蛋白ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)的鸟苷酸交换因子(Guanine- nucleotide exchange factor, GEF), 在所有真核生物中, 大型ARF-GEF都是高度保守的。它在生物体的膜泡分拣和蛋白运输中发挥着重要作用, 近年来关于ARF-GEFs的蛋白结构、亚细胞定位和相关功能的报道很多, 它已成为细胞生物学领域的一大研究热点。文章主要介绍了大型ARF-GEF的蛋白结构和在不同物种中的分布, 阐述了该基因家族在酵母、人和拟南芥中的相关进展, 并对其调控机理进行了小结。     

PALM成像中激光强度和定位精度相关性的研究

近十年来,基于单分子定位的PALM成像技术快速发展,将显微镜的分辨率提高到了2-25nm。本文发现PALM成像过程中采用的激发光强度与成像的定位精度之间有密切的联系。我们分别选择了PALM成像使用的光激活荧光蛋白、光转换荧光蛋白和光开关荧光蛋白中最常用的荧光蛋白进行验证。实验发现伴随激光强度的增加,大部分荧光蛋白的光子数先升高然后趋于饱和,背景噪声几乎线性升高。进一步分析发现荧光蛋白的定位误差随着激光强度增强先降低后升高,因此选用合适的激光强度在PALM成像实验中至关重要。如何提高PALM成像的分辨率一直是科学家研究的热点,本研究内容可以指导研究人员在PALM成像中选用合适的激发光强度,从而得到高分辨率的图像。     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

莲品种DNA指纹图谱的构建

为了克服单纯依据形态特性鉴定品种的局限性, 我们开展了莲品种DNA指纹图谱构建研究, 旨在对其品种的快速准确鉴定及专利权保护等起一定作用。本研究以圆明园保存的72个莲品种为实验材料, 用来自不同地点的1,409份野生莲(Nelumbo nucifera)和58份美洲黄莲(N. lutea)群体样本作遗传背景参照。从104对核微卫星引物(nSSR)中筛选出15对, 从17对叶绿体微卫星(cpSSR)引物中筛选出2对, 共17对引物作为72个莲品种DNA指纹鉴定的条码。15对nSSR引物共检测到94个等位基因(平均6.27个), 其中11个属于美洲黄莲, 65个属于野生莲, 18个不能区分; 多态信息含量(PIC)介于0.3899-0.8023之间 (平均0.5748)。2对cpSSR引物共检测到13个单倍型, 其中9个属于野生莲, 4个属于美洲黄莲。全部17对引物标记结果显示, 共有19个品种含有美洲黄莲遗传组分, 其中8个母系来源于美洲黄莲; 有36个品种(涉及12对引物)具有至少1个特有基因型; 最少8对引物组合可完全区分开68个品种。有2组共4个品种组内全部17对引物均不能区分。本研究通过核心引物组合法使68个莲品种获得特异性DNA指纹。推荐13对nSSR和2对cpSSR共15对引物作为莲品种鉴定的核心条码, 并建议将形态特征与DNA指纹相结合作为莲品种的鉴定标准。     

不同有机氮效率的甜菜基因型筛选及差异分析

通过对不同基因型甜菜土壤有机氮利用及吸收效率的筛选和差异分析,为土壤有机氮高效基因型甜菜的栽培及品种选育提供理论依据。2014-2015年选取100份不同基因型的甜菜材料通过室内及田间试验在甜菜的不同发育阶段比较并分析土壤有机氮效率,筛选出对有机氮利用及吸收效率均显著差异的高效和低效基因型甜菜材料。结果表明,初步筛选得到的有机氮高效基因型甜菜材料KWS8138、HI0466和有机氮低效基因型甜菜材料BETA176、T230苗期全株及根部有机氮利用效率（Organic Nitrogen Use Efficiency,ONUE）差异显著;之后通过田间试验对有机氮吸收效率（Organic Nitrogen Assimilation Efficiency,ONAE）做了进一步筛选,发现KWS8138不但对ONUE有显著优势,还具有较高的有机氮素吸收能力,包括苗期之后对土壤有机氮素的运转量较高,合理的根冠比等。有机氮低效基因型甜菜材料BETA176的有机氮素吸收利用能力很弱、氮素转运能力过低等限制了植株对有机氮素的合理利用,不利于有机氮效率的提高。因此确定KWS8138为有机氮高效基因型材料,BETA176为有机氮低效基因型材料,均可作为进一步试验的材料。有机氮高效基因型甜菜较高的土壤有机氮转运量及合理的根冠比促进了其对有机氮素的吸收,是有机氮高效的基础。较高的干物质生产效率反应了甜菜对有机氮素的高效利用,是有机氮高效的关键。     

rhIL-12二硫键、N-糖基化位点及C端氨基酸序列分析

重组人白细胞介素12（rhIL-12）是一种已经用于治疗肿瘤,寄生虫、病毒性感染及造血障碍等疾病研究的异二聚体糖蛋白。结构确证是质量控制的重要内容,此研究对CHO细胞表达的rhIL-12二硫键配对方式、N-糖基化位点以及C端氨基酸序列进行了分析,使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C三种酶分别对rhIL-12进行非还原酶解,尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段,然后使用LC-MS/MS对酶解后的肽段样品进行分析,确定了rhIL-12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键。将rhIL-12二硫键还原后并烷基化修饰保护,分别采用Trypsin,Chymotrypsin和GluC进行酶解,并用LC-MS/MS对酶解后肽段进行了质谱肽图及C端氨基酸序列分析,确定了rhIL-12 p35亚基C端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基C端氨基酸序列的15个氨基酸。对rhIL-12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解,所得肽段在H₂O及H₂¹⁸O水中分别用PNGase F糖苷酶处理酶切产物。并通过二级质谱分析脱糖后糖肽段分子量变化,从而确定了rhIL-12的3个N糖基化修饰位点,分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位。通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法,证明了新药rhIL-12的二硫键位点、C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致。     

免疫融合蛋白sFcεRIα/mIg(IgG2)的研制

哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等疾病为一类常见疾病,但存在治疗效果不佳,患者病程长等特点。IgE 分子是导致过敏性疾病的关键分子。抑制IgE分子与效应细胞膜表面FcεRI受体的结合可抑制过敏反应的发生。通过克隆FcεRI受体α亚基的cDNA与IgG2的稳定区铰链区、CH2和CH3的cDNA连接,以二聚化融合蛋白sFcεRIα/mIg(IgG2)的形式在CHO细胞中表达,达到提高sFcεRIα生物半衰期的目的。表达载体构建和初步的功能性试验等一系列研究证实,所表达的融合蛋白的分子量为170kDa,并与人IgE和鼠IgE有较好的结合活性。这些研究为该融合蛋白最终实现产业化打下良好基础。     

贵州三都水族Y染色体单倍型频率分析

在92例贵州三都水族个体中,用PCR-RFLP法研究由11个单核苷酸多态位点(SNPs)组成的Y染色体单倍型频率分布,结果显示该人群的Y染色体主要为南方特异的H11和H9单倍型,两者频率高达90.22％。主成分分析结果显示其父系遗传结构与我国黎族、布依族等汉藏语系壮侗语族民族最为接近。通过Y染色体的遗传学观察与历史记载和语言学分类有较好一致性。 Abstract:Non-recombination region of Y-chromosome is a useful marker in tracing evolutionary history of paternal lineage.In the present study,total 92 individuals from Shui ethnic group in Sandu Shui Ethnic Group Autonomous County of Guizhou Province were inspected with 11 SNP sites including M7,M9,M15,M45,M89,M95,M119,M122,M130,M134 and YAP on Y-chromosome.All the subjects were required to be unrelated and without intermarriage with other ethnic groups within three generations.The haplotypes were analyzed by PCR-RFLP method.Four haplotypes H5,H8,H9 and H11 were detected with frequencies of 0.054,0.044,0.315 and 0.587,respectively.Principle component indicated that the paternal lineage of Shui ethnic group is much closer to Li ethnic group of Hainan Province and Bouyei ethnic group of Guizhou Province,which belong to the group of Zhuang-Dong branch of Sino-Tibetan language family.In addition genetic study of Shui coincides with its linguistic distribution.