6株A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1（1D）基因的核苷酸序列分析

早期收集保藏的６株Ａ型口蹄疫病毒（ＦＤＭＶ）（ＡＬ１－ＡＬ６）,适应ＢＨＫ２１单层细胞后,提取６株细胞增殖病毒的ＲＮＡ。用一对ＦＭＤＶ通用引物经反转录（ＲＴ）－ＰＣＲ法扩增了约５００ｂｐ的期望的ＤＮＡ片段。克隆目的的基因后,采用双脱氧ＤＮＡ链末端终止法测得了６株病毒的ＶＰ１基因２１０－６３９核苷酸序列。分析表明,３株病毒缺失３个核苷酸,从推导的氨基酸序列比较,确定缺失的３个核苷酸正好是一个密码子,     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力

【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12x3c和pAdcmv-p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中.重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变.取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24~48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达.取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在.本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

口蹄疫病毒O型中和抗体检测固相阻断ELISA方法的建立

【目的】为评价O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)灭活疫苗免疫后中和抗体(neutralizing antibodies,NA)水平,建立检测中和抗体的固相阻断ELISA (neutralizing antibodies solid-phase blocking ELISA,NA-SPBE)方法。【方法】本研究以本实验室前期制备的FMDV广谱反应性牛源单克隆抗体E32作为捕获抗体,以生物素标记的FMDV O型型内广谱中和牛源单克隆抗体C4作为检测抗体,经过条件优化建立了检测FMDV O型中和抗体的固相阻断ELISA方法,并对该方法进行了敏感性、特异性、重复性、交叉反应性与病毒中和试验(virus neutralization test,VNT)相关性等试验。【结果】抗体E32最佳包被浓度为0.5 μg/mL,O型FMDV灭活抗原最佳稀释浓度为0.25μg/mL,生物素标记抗体C4-Bio最佳工作浓度为0.06 μg/mL,链霉亲和素-HRP的最佳稀释度为1:40 000。以1.35 log₁₀作为效价判定临界值时,敏感性和特异性分别为97.14%和98.84%。利用该方法分别检测FMDV A型、FMDV Asia1型、BVDV、PRRSV、CSFV、PPRV抗体阳性血清时,均为阴性,未出现交叉反应。该方法批内和批间重复试验的变异系数均<10%,表明其重复性较好。利用该方法与VNT分别对160份血清样品进行检测,二者的相关系数r为0.807 5,P<0.000 1,相关性显著。【结论】该方法可以检测FMDV O型中和抗体,为FMDV O型灭活疫苗免疫效果评价提供有力技术支撑。     

Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点多样性

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

2017–2022年中国口蹄疫流行状况分析

【目的】分析近年来中国口蹄疫流行和传播特点,研判口蹄疫流行趋势。【方法】以2017-2022年间中国报告发生的口蹄疫疫情为研究对象,从疫情的“三间分布”、生产环节分布、流行毒株分子流行病学分析及溯源等方面,对近6年的疫情情况进行系统梳理。【结果】2017-2022年间中国共有15个省份报告发生口蹄疫疫情54次。总体形势稳定：Asia 1型口蹄疫维持无疫状态;2019-2022年连续4年未发生A型口蹄疫疫情;田间以散发O型口蹄疫为主。六年间报告牛口蹄疫疫情36次,羊疫情1次,猪疫情17次。分子流行病学研究表明,O/Mya-98、O/Ind-2001、O/CATHAY、O/PanAsia和A/Sea-97这5个流行毒株同时流行,且与同时期周边国家（缅甸、老挝和越南等）口蹄疫毒株遗传关系密切。流行病学调查结果显示,疫情（尤其是牛疫情,占比66.7%）主要发生在流通（57%）、散养（32%）等免疫薄弱环节。【结论】对内强化疫苗免疫和流通动物管控,对外严防境外毒株传入仍是今后中国口蹄疫防控的重要任务。     

口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNA Bac-N-Blue^TM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。     

含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

[目的]构建含有精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸(RGD)受体结合位点口蹄疫病毒(FmDV)Asial/JS/Chind2005株的全长感染性cDNA克隆.[方法]采用定点突变方法,构建Asial型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD.pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒peDNATIP共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救.[结果]序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asial/JS/China/2005全长cDNA克隆.共转染试验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asial/JS/China/2005株FMDV.[结论]该试验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础.