野猪MC4R基因的克隆及变异初步研究

黑素皮质素受体4是在人类肥胖研究中发现的重要调节因子,参与调节动物的体重、采食量和能量稳态,缺失MC4R基因的突变纯合体小鼠出现遗传性肥胖。为了进一步揭示其群体遗传变异,寻找新的遗传标记,本研究对野猪(Sus scrofa ussuricus)MC4R基因进行了克隆(GenBank accession NoDQ388767)和序列分析,并对所发现的错义突变进行了基于限制性内切酶HindⅢ的PCR-RFLP分析。序列分析表明野猪与民猪MC4R基因的编码区序列完全相同,与大白猪相比存在4个SNPs;对14头野猪的酶切多态性分析表明该突变位点是多态位点,并且3种基因型的分布符合Hardy-Weinberg定律。结果表明,野猪具有独特的遗传信息。     

鼠尾草酸对Aβ损伤海马神经元的保护作用研究

采用Aβ诱导建立海马神经元损伤模型,CCK-8检测神经元的活性,RT-PCR检测神经元凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达,探讨了鼠尾草酸对Aβ所致海马神经元损伤的保护作用及其机制。结果显示,浓度在5~10μmol/L时,鼠尾草酸预处理能显著下调Aβ损伤导致的Caspase-3 mRNA表达的升高,增强神经元活力。表明鼠尾草酸预处理可以保护Aβ所致小鼠海马神经元的损伤,其机制可能与鼠尾草酸调控神经元凋亡相关基因caspase-3 mRNA的表达有关。     

中华苜蓿根瘤菌噬菌体的分离及主要壳蛋白基因g23的系统进化分析

【目的】揭示苜蓿根瘤菌噬菌体的形态学特征及主要壳蛋白g23基因的分布地位,为根瘤菌噬菌体的生态学研究提供数据支持。【方法】以中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti USDA1002T)为宿主,采用双层平板法分离土壤环境中的苜蓿根瘤菌噬菌体,利用电子显微镜观察纯化的噬菌体形态特征;提取噬菌体DNA,PCR扩增编码噬菌体壳蛋白的g23基因,构建系统进化树,以形态学鉴定和分子生物学相结合的方法,明确分离获得的苜蓿根瘤菌噬菌体g23基因的系统进化地位。【结果】分离获得了3株噬菌体,头部均呈二十面体,直径大小为81–86 nm,尾部有收缩尾鞘,长度大约为54–70 nm。克隆测序结果显示,获得的3株噬菌体g23基因株间相似度较高,但与可培养的Exo T-、Schizo T-、T-、Pseudo T-evens相似度较低。系统进化分析表明,获得的3株噬菌体不隶属于目前已划分的不同环境噬菌体g23基因的分类类群中。【结论】3株噬菌体均属于肌尾噬菌体科的裂性噬菌体,与目前获得的所有噬菌体g23基因相似性较低,属于新的侵染中华苜蓿根瘤菌的噬菌体株。     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶HspB的结构研究

在蛋白晶体结构难以获得的情况下,通过设计突变体来获取6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶Hsp B的结构信息。首先获取Hsp B蛋白的同源序列并进行比对,之后对Hsp B蛋白进行同源建模和从头建模,并与底物2,5-二羟基吡啶(HSP)进行对接模拟;通过分子模拟、序列比对和参考同源蛋白晶体三种方式,设计并构建Hsp B酶的25个突变体;通过突变体的表达纯化和酶动力学常数测定来研究Hsp B的结构性质。根据实验结果,推测FAD的正确结合在稳定Hsp B蛋白结构中具有重要的作用,同时推测底物HSP和辅酶NADH处于同一活性中心并与不同位点相互作用。吡啶衍生物是极具工业价值的化合物,生物催化法是合成吡啶衍生物的有效途径,而吡啶衍生物的生物催化研究较少,通过考察突变体的性质,推测了Hsp B的部分结构信息,为此类吡啶单加氧酶的工业改造和应用奠定了基础。     

卵壳超微结构观测去内膜新方法

在对鸟类卵壳超微结构进行研究时 ,卵壳内表面有一层极薄而且坚韧的内膜很难除去 ,现阶段唯一的方法是用小镊子在实体显微镜下剥离。但由于内膜纤维深入乳锥 ,与乳锥之间的纤维交织在一起 ,且长入乳突内 ,使膜与卵壳紧密结合 ,常常剥离不下来。我们在进行卵壳超微结构研究时 ,用蛋白酶溶解卵壳内膜 ,获得了很好的结果。1　材料与方法取新鲜鸡蛋蛋壳 ,蛋白酶Ｋ。将 10ｍｇ蛋白酶Ｋ溶于 1ｍｌ灭菌Ｈ2 Ｏ中 ,按 2 0 0 μｌ分装贮存于 - 2 0℃。配制组织提取液 10 0ｍｌ:1ｍｏｌ ＬＴｒｉｓ ｃｌ(ｐＨ8.0 ) 5ｍｌ;0 5ｍｏｌ ＬＥＤＴＡ (ｐＨ8.…     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶的纯化与结晶条件

【目的】在大肠杆菌中克隆表达尼古丁降解关键的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶基因hspB,纯化重组HspB蛋白并进行结晶条件的初步研究。【方法】从恶臭假单胞菌S16基因组中PCR扩增hspB基因,构建重组表达载体pET28a-hspB,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对HspB蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】本文成功构建重组质粒pET28a-hspB并纯化获得达到结晶纯度的HspB蛋白。结晶条件初筛和优化后获得可培养HspB蛋白晶体的条件为0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L HEPES pH 7.5、1.1 mol/L(NH4)2SO4、4°C、加晶种。【结论】HspB蛋白纯化体系的构建和结晶条件的初步研究为从结构生物学的角度进一步研究HspB结构与功能的关系、定向进化提高HspB催化效率奠定了基础。     

山豆根正丁醇部位化学成分及其抗菌活性研究

山豆根为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis)的干燥根和根茎,常用于治疗咽喉部感染性疾病,其大极性提取物已经报道了具有较好的抑菌活性潜力。为了深入探究山豆根大极性抗菌活性成分,该文综合运用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、半制备HPLC等分离纯化方法对山豆根正丁醇部位化学成分进行分离鉴定,并开展了单体成分抗细菌(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌)和真菌(白色念珠菌)的活性评价。结果表明:从山豆根正丁醇部位中共分离鉴定得到10个化合物,分别为2',4',7-trihydroxy-6,8-bis(3-methyl-2-butenyl) flavanone (1)、染料木苷(2)、2-(2',4'-二羟基苯基)-5,6-二氧亚甲基苯并呋喃(3)、maltol-β-D-glucopyranoside (4)、leonuriside A (5)、松柏醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、光甘草酚(7)、2-(2',4'-dihydroxy-phenyl)-8,8-dimethyl-10-(3-methyl-2-butenyl)-8H-pyrano [2,3-d]chroman-4-one (8)、氧化苦参碱(9)、番石榴酸(10),其中化合物4-6首次从该植物中分离得到。生物活性测试结果表明化合物1-3具有一定的抑菌作用,化合物2对绿脓杆菌的最小抑菌浓度(MIC)值为15.6μg·mL~(-1),化合物3对白色念珠菌和大肠杆菌的MIC值均为31.3μg·mL~(-1)。     

1%硝酸异康唑乳膏治疗体股癣、足癣疗效和安全性评价

目的评价1%硝酸异康唑乳膏治疗足癣和体股癣的疗效及安全性,并与2%硝酸咪康唑霜对照。方法采用多中心随机双盲对照试验。试验组及对照组分别外用1%硝酸异康唑乳膏和2%硝酸咪康唑霜,2次/d,疗程足癣4周,体股癣2周。结果足癣试验组71例,对照组72例;体股癣试验组73例,对照组73例。足癣患者在4周时临床有效率试验组87.3%,对照组87.5%,在6周时分别为88.7%和91.7%;在4周时真菌学清除率试验组83.1%,对照组94.4%（P=0.0363）,在6周时分别为84.5%和90.3%;在4周时总有效率试验组77.5%,对照组86.1%;在6周时分别为78.9%和86.1%。体股癣患者在2周时临床有效率试验组87.7%,对照组93.2%,在4周时分别为91.8%和94.5%;在2周时真菌学清除率试验组82.2%,对照组89.0%;在4周时分别为89.0%和93.2%;在2周时总有效率试验组78.1%,对照组86.3%,在4周时分别为87.7%和93.2%。与药物相关的不良反应发生率试验组为2.1%,对照组为1.4%,表现为用药局部刺激、瘙痒、灼痛感或红斑。结果显示1%硝酸异康唑乳膏治疗足癣和体股癣的疗效及安全性与2%硝酸咪康唑霜相似（P〉0.05）。结论1%硝酸异康唑乳膏治疗足癣和体股癣有效、安全。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。