sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

目的:从HL-60细胞中获得了sTrail基因片段,优化蛋白表达条件,并研究其抗肿瘤活性。方法:培养HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,并将目的基因克隆至原核表达载体p ET28a上,并电击转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,Ni-IDA柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱鉴定。纯化后的重组蛋白作用HUVEC,He La,Hep-3B,HCT-116,MDA-MB-231,H460细胞检测蛋白生物学作用。结果:DNA测序结果证实成功构建了重组质粒p ET28a-sTrail,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱检测显示成功表达sTRAIL蛋白,MTT法和流式细胞术结果显示,sTRAIL蛋白对肿瘤细胞包括He La,HCT-116,MDA-MB-231,H460,Hep-3B细胞有良好的生物活性,对正常的HUVEC细胞无毒性。结论:成功构建可以高效表达sTRAIL蛋白的原核表达载体,优化蛋白的表达和纯化后所得sTRAIL蛋白具有良好的抗肿瘤生物活性,为研究和发展利用sTRAIL蛋白作为临床治疗抗肿瘤药物提供了重要基础。     

条盖盔孢伞子实体及菌丝体中鹅膏毒素检测

条盖盔孢伞(Galerina sulciceps)是一种有毒蘑菇,近年来在中国南方发生了多起因误食该菌引起的中毒事件。在分离获得纯培养物的基础上,采用高效液相色谱(HPLC)法检测分析了条盖盔孢伞子实体和菌丝体中的鹅膏毒素。结果显示野生条盖盔孢伞子实体(干质量)含有α-amanitin和β-amanitin分别为868.32μg/g和406.56μg/g,液体发酵培养的菌丝体中未检测到α-amanitin和β-amanitin。     

复方黄连素片中盐酸小檗碱含量测定

目的：建立测试黄连素片中盐酸小檗碱含量的高效液相方法,并对此方法进行系统的方法学验证,以确保应用该方法测试的结果准确、可靠。方法：采用色谱柱：Agilent TC-C18柱（4．6 mm ×150 mm,5μm,Agilent,美国）,流动相：乙腈－0．05 mol／L磷酸二氢钾溶液（45∶55,含5％的0．05 mol／L庚烷磺酸钠溶液）,检测波长为265 nm。结果：盐酸小檗碱在2．5～80μg／mL范围内线性关系良好,得到线性回归方程为Y＝421 ．5X＋17．32,相关系数为0．9997（n＝6）;低、中、高浓度批内精密度的RSD值分别为0．30％、0．58％、0．30％,批间精密度的RSD为0．80％;重复性RSD为0．27％;低、中、高浓度的加样回收率分别为99．66％、99．88％、99．98％;供试品溶液室温放置8h稳定,RSD为0．41％。结论：本方法测定黄连素片中盐酸小檗碱的含量准确、可靠,操作简单、用时短,可用于黄连素片中盐酸小檗碱的含量测定。     

SCoT分子标记在植物研究中的应用进展

SCo T是一种新型的目的基因分子标记,该标记不仅能获得与性状联系紧密的目的基因,而且能对性状进行跟踪,已被广泛应用于多种植物的研究。本文概述了SCo T标记的原理、引物设计方法及特点,并从PCR反应体系建立与优化、种质资源遗传多样性与亲缘关系分析、种质鉴定与指纹图谱构建、基因差异表达与分子遗传连锁图谱构建等方面总结了SCo T标记的应用进展。同时,对其存在的问题进行了讨论,并展望了该标记的发展应用前景。     

改善大肠杆菌衍生型重组双层轮状病毒样颗粒的特性与保护效力

<正>在中高等收入的国家中有效的轮状病毒活疫苗在资源有限的地方的婴儿中却免疫原性和有效性较差。病毒样颗粒(VLP)是轮状病毒疫苗研究有希望的途径,但大规模的VPL生产仍旧是个挑战。此研究用大肠杆菌表达轮状病毒的衣壳VP2和VP6蛋白,通过纯化后的组装工艺高效的组装成同源单层VP6-VLPs或双层VP2/6-VLPs有(d12/6-VLPs),d12/6-VLPs有较好的热稳定性和抗原性。虽然     

幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。     

在真核细胞表达制备重组人前蛋白转化酶枯草溶菌素9

分别优化、合成和构建了在毕赤酵母和哺乳动物细胞表达人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)的PCSK9-p PICZαA和PCSK9-pcDNA4.0重组质粒,将重组质粒转化至GS115细胞和转染至中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞,诱导细胞表达包含his标签的PCSK9重组蛋白。通过SDS-PAGE电泳和Western-blot分析两种系统表达重组蛋白的能力,发现GS115表达的重组蛋白相对分子质量大于人天然PCSK9蛋白且容易发生降解,而CHO细胞能够高表达与人天然PCSK9蛋白相对分子质量相同的、稳定的、易于纯化的特异重组蛋白。采用His/Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,获得纯度达90%以上的PCSK9重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了高效价特异性PCSK9多克隆抗体。所建立的CHO细胞表达体系PCSK9的平均表达量为5.6 mg/L,为开发PCSK9抑制剂和深入研究PCSK9分子结构和功能奠定了基础。     

高丛蓝莓类黄酮3′-羟化酶基因F3′H的克隆及表达特性分析

以高丛蓝莓(Highbush blueberry)"喜来(Sierra)"和"日出(Sunrise)"为研究材料,通过RACE(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术获得蓝莓(Vaccinium ssp.)F3′H基因的全长c DNA序列,并使用生物信息学工具对该基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质、二级和三级结构,以及氨基酸序列的相似性等进行了预测和分析。利用荧光定量PCR(RT-q PCR)手段来检测其在蓝莓果实不同发育时期表达情况。结果表明:Vs F3′H全长c DNA为1 871 bp,编码530个氨基酸,蛋白相对分子质量为58.33 k D,理论p I值为7.32;蛋白疏水性指数为0.004,属于疏水性蛋白,二三级结构预测可知其富含α-螺旋和无规则卷曲。RT-q PCR发现Vs F3′H主要在果实发育前期表达量较高,蓝果期表达量明显下调,且在不同品种中以蓝果期的表达量差异显著。这些研究结果为解析蓝莓果实色泽发育及果树分子育种奠定了理论基础。     

家蚕Bmyan基因的克隆表达和作为microRNA 7靶基因的验证

microRNAs(miRNAs)是一类长约22 nt的非编码RNA,通过与其靶基因3′端非翻译区(3′-UTR)的结合来调节各项生命活动。克隆表达家蚕Bmyan基因,验证其是否是bmo-miR-7的靶基因对于深入研究家蚕变态发育机制有重要意义。基于同源性检索和PCR扩增,克隆了家蚕Bmyan基因CDS全长,编码476个氨基酸。序列分析表明,家蚕YAN蛋白的氨基酸序列保守,含SAM-PNT和ETs结构域。芯片数据、RT-PCR和定量PCR的检测结果表明,Bmyan在五龄3 d的家蚕头部、体壁、卵巢中高量表达,在其余组织中低量表达或不表达。在幼虫期,Bmyan表达水平相对较低,但在上蔟期和蛹期前4 d高量表达。通过3′RACE克隆了Bmyan基因的3′-UTR。RNAhybrid在线软件预测了其3'-UTR上bmo-miR-7的两个靶位点。构建了含有Bmyan基因3′-UTR和荧光素酶报告基因的转染载体,将该载体与bmo-miR-7的mimics序列共转染到家蚕胚胎细胞系BmE中,通过测定荧光素酶的活性,证明了Bmyan基因是bmo-miR-7的靶基因。本研究为进一步揭示bmo-miR-7和Bmyan在家蚕体内的生物学功能奠定了基础。     

香蕉类甜蛋白基因MaTLP1的克隆与表达分析

在香蕉EST文库中,通过RACE技术克隆到1个香蕉类甜蛋白基因的全长序列。该序列最大开放阅读框942 bp,编码313个氨基酸。Blast分析发现,它与其他类甜蛋白相似度为56.10%,含有类甜蛋白（TLPs）特有的保守结构域,命名为MaTLP1。系统进化树表明,MaTLP1基因编码蛋白与海枣的亲缘关系较近,与香蕉的进化模式相似。组织特异性分析表明,MaTLP1在根、球茎、假茎中的表达量高,叶中较弱,花和果实中微量表达。实时荧光定量PCR分析显示,在抗病香蕉品种中,接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)枯萎病菌后MaTLP1基因上调表达,在感病香蕉品种接菌2 d后MaTLP1基因受到抑制,虽然在接菌4 d 后上调表达,但是相对于抗病品种上调较小。研究表明,MaTLP1基因可能在香蕉抗枯萎病的过程中起作用。