狂犬病病毒颗粒的蛋白质组学分析

狂犬病病毒是一种囊膜RNA病毒,主要侵害中枢神经系统,引起人和哺乳动物致命性的脑脊髓炎。现有研究表明囊膜病毒颗粒从感染的细胞中出芽释放时会携带许多可能在病毒的复制过程中发挥重要作用的宿主蛋白。尽管先前已报道某些宿主蛋白可掺入到狂犬病病毒颗粒上,但还没有系统地鉴定狂犬病病毒颗粒上的蛋白质组成。为了理解病毒与宿主间的相互作用的分子机制,本研究在病毒培养和蔗糖密度梯度超离心纯化的基础上,采用蛋白质组学方法分析了纯化的狂犬病病毒颗粒(SRV9弱毒疫苗株)上的蛋白质组成。除了检测到狂犬病病毒编码的五个结构蛋白以外,我们还检测到了50个宿主编码的蛋白。按功能可将其分成十类:胞内转运蛋白(14%),分子伴侣(12%),细胞骨架蛋白(24%),信号转导蛋白(8%),转录调节蛋白(12%),钙离子结合蛋白(6%),酶结合蛋白(6%),代谢作用蛋白(2%),泛素化蛋白(2%),其他功能的蛋白(14%)。利用免疫印迹方法对病毒颗粒上的4个宿主蛋白(肌动蛋白,微管蛋白,微丝结合蛋白和热应激同源蛋白70)进行了验证。本研究首次鉴定了狂犬病病毒颗粒上的宿主蛋白组成,有助于进一步研究该病毒复制与感染机制。     

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析

为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3(Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。     

PEG修饰青蒿素脂质纳米粒的体外释放及抗巨噬细胞摄取特性

研究聚乙二醇硬脂酸酯(PEGn-SA)修饰的青蒿素脂质纳米粒(PEGn-ART-NLC)体外释放及抗巨噬细胞(J774)摄取特性。采用高压乳匀法制备PEGn-SA(n=25、40、55)修饰的PEGn-ART-NLC及未修饰的青蒿素脂质纳米粒(ART-NLC),进行体外释放试验、抗吞噬实验、利用Gouy-Chapmann理论计算固定水化层厚度(FALT),并加以比较。在p H 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中,药物的体外释放度随PEGn-SA聚合度的改变而改变;加入血浆后,亦有改变。J774细胞对PEGn-ART-NLC的摄取量随PEGn-SA聚合度及J774细胞与制剂孵育时间的改变而改变;加入血浆孵育后,亦有改变。ART-NLC及三种PEGn-ART-NLC的固定水化层厚度分别为0.31、1.76、1.86和2.04 nm。结果表明该制剂体外具有良好的缓释特性及抗J774细胞吞噬性。     

停乳链球菌对日本沼虾总超氧化物歧化酶活性的影响

对健康的日本沼虾(1.40±0.12)g分别肌肉注射0.6×10~6、2×10~6、4×10~6、6×10~6 CFU/mL的停乳链球菌茵液10μL、注射后3 h、6 h、9 h、12h、24h、5d、10d分别采集肝胰腺、肌肉和鳃组织,测定其中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,研究停乳链球菌时日本沼虾T-SOD活性的影响,研究结果显示,肝胰腺中T-SOD活性于注射5d后达到最大值(P0.05),10d后0.6×10~6、2×10~6和4×10~6 CFU/mL,组T-SOD活性下降并接近对照组水平,而最高浓度组(6×10~6 CFU/mL)T-SOD酶活性仅有对照组的46%。肌肉和鳃中T-SOD活性均在注射6 h后达到最大值,注射10 d后,4×10~6和6×10~6 CFU/mL组的肌肉和6×10~6 CFU/mL组的鳃组织中T-SOD活性均仅有对照组的50%左右。另外,肌肉组织中T-SOD的峰值远高于鳃和肝胰腺组织中的峰值。上述结果表明,停乳链球菌不仅影响日本沼虾机体T-SOD酶的活性。而且肌肉、鳃和肝胰腺组织中酶的活性应答时间不同,且组织内酶活性的应答与菌的感染方式有关,另外,注射高浓度停乳链球菌长时间后会降低其组织中T-SOD酶活性。     

PARP-1、AIF在大鼠脊髓损伤后细胞凋亡中的作用

目的探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)、凋亡诱导因子(AIF)在大鼠脊髓损伤后细胞凋亡中的作用。方法脊髓损伤模型以Allen’s法制备。成年健康SD大鼠随机分为损伤组、PARP-1抑制剂组和假手术组。每组再分1d、3d、7d、14d时间点。苏木精-伊红(HE)染色观察脊髓组织形态学变化;用免疫组织化学方法检测各组各时间点PARP-1、AIF的表达变化;原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导dUTP标记法(TUNEL)检测细胞的凋亡水平。结果 HE染色结果显示,与假手术组相比,损伤组脊髓结构破坏明显,大量炎性细胞浸润,许多神经元变性坏死;抑制剂组与损伤组比较,脊髓损伤程度减轻,存活神经元较多。免疫组化结果显示,与假手术组相比,术后1~14d损伤组脊髓PARP-1、AIF表达明显增强(P0.57),且于3d达高峰(P0.05);与损伤组相比,抑制剂组各时间点脊髓PARP-1、AIF阳性表达均显著降低(P0.05)。TUNEL结果显示,与假手术组比较,损伤组阳性细胞凋亡率明显升高,且在损伤后3d最高(均P0.05);而抑制剂组各时间点细胞凋亡率均明显低于损伤组,但高于假手术组(均P0.05)。结论大鼠脊髓损伤后存在PARP-1、AIF介导的细胞凋亡,二者在损伤后细胞凋亡的早期可能起重要作用。     

放牧干扰下高原鼢鼠栖息地选择因素

以祁连山东段高寒草甸栖息的高原鼢鼠(Myospalax baileyi)为研究对象,探讨放牧干扰下高原鼢鼠适合栖息地选择的影响因素,为合理控制草原鼠害和保护生物多样性提供科学依据。在5个不同放牧强度小区中,连续3年监测高原鼢鼠相对种群密度变化,同时获取植被和土壤的变化数据。分析高原鼢鼠相对种群密度、植被(盖度、高度、频度、植被生物量、植被均匀度、丰富度、多样性和地下根系生物量)和土壤(紧实度、容重、水分)之间的关系。中度放牧干扰下,高原鼢鼠相对种群密度最低,不利于对栖息地的选择,轻度、次轻度放牧区的高原鼢鼠相对种群密度高于重度、次重度放牧区的;轻度放牧干扰的草地有利于高原鼢鼠种群数量的增加。高原鼢鼠相对种群密度与土壤紧实度、容重呈显著负相关(R=﹣0.921、﹣0.883,P0.05);与土壤水分呈显著正相关(R=0.879,P0.05);高原鼢鼠相对种群密度与地下根系生物量呈极显著正相关(R=0.982,P0.01),与植被丰富度呈显著正相关(R=0.921,P0.05),与地上植被总盖度呈显著正相关(R=0.909,P0.05),与地上生物量、均匀度、多样性呈不显著正相关(P0.05)。在草地放牧干扰系统中,非生物因素土壤紧实度、水分可能是高原鼢鼠栖息地选择的首要选择因素,食物资源也许是次要选择因素。     

岑溪药用野生稻高效内生固氮菌分离及促生特性

【目的】以广西岑溪市野生稻保护区的药用野生稻为材料,分离纯化内生细菌,筛选固氮酶活性较高和对作物促生效果较好的菌株。【方法】利用乙炔还原法检测固氮酶活性,采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱技术对分离到的固氮菌进行聚类。利用16S rRNA基因和nifH基因确定其系统发育地位。采用钼锑抗比色法、Salkowski比色法和CAS检测法分别测定菌株溶磷性、生长素的分泌能力和产铁载体能力。通过平板和盆栽试验检测其对水稻的促生作用。【结果】共分离得到35株内生固氮菌,分为6个类群。其中CX24固氮酶活性最高,经鉴定属于Klebsiella variicola,其固氮酶活性为298.64 μmol/(L·h),为参比模式菌株DSM15968的9倍。另外该菌株还具有较高的溶磷性、分泌生长素和产铁载体能力,能够有效地促进水稻的萌发和生长。【结论】菌株CX24属于Klebsiella variicola,是一株高效内生固氮菌,具有很好的生产应用前景。     

皱胸尖裂姬蜂对机敏异漏斗蛛的拟寄生行为及其发育特征

寄生蜂是蜘蛛的主要天敌类群之一,但寄生于漏斗蛛的寄生蜂种类较少,且缺乏相关寄生蜂的详细研究报道。我们研究了皱胸尖裂姬蜂(Oxyrrhexis rugosus)对机敏异漏斗蛛(Allagelena difficilis)的拟寄生,旨在揭示蜘蛛寄生蜂的拟寄生行为及其发育特征。显微镜下观察了12头机敏异漏斗蛛头胸部背面的皱胸尖裂姬蜂卵,并以均值法统计了皱胸尖裂姬蜂各发育阶段的历期,进一步观察了皱胸尖裂姬蜂寄生机敏异漏斗蛛后对寄主的影响。交配后的雌性皱胸尖裂姬蜂经过寻找、降落、蛰刺蛛体后伺机将卵产在机敏异漏斗蛛的头胸部背面后部;孵化后的皱胸尖裂姬蜂幼虫头部形成一个特殊摄食导管,通过摄食导管获取蛛体的营养;幼虫随着龄期增长,体色由浅变深,历期约10 d;幼虫老熟后在蛛网的漏斗状管道内结茧化蛹,蛹期约为12 d;成体雌、雄蜂寿命约为11 d,皱胸尖裂姬蜂的平均生活史周期约为33 d。皱胸尖裂姬蜂寄生后对寄主蜘蛛的行为和生活状态造成了严重的影响,随着幼虫龄期增长被寄生机敏异漏斗蛛不再进食、蜕皮,活动减少,蛛体逐渐萎缩,直至老熟幼虫离开蛛体时,蜘蛛死亡。该研究不仅增加了漏斗蛛寄生性天敌的已知种类,而且初步了解了以漏斗蛛为寄主的姬蜂的产卵行为、后代的发育特征以及对寄主蜘蛛的影响,这将为研究蜘蛛寄生蜂及其与寄主蜘蛛之间的化学通讯和协同进化提供重要的基础资料。     

基于几何形态测量学的黄蜻翅的雌雄二态性研究

【目的】本研究运用几何形态测量学方法对黄蜻Pantala flavescens Fabricius前翅和后翅的雌雄二态性进行分析,探讨黄蜻雌雄性在翅上的形态差异。【方法】通过对黄蜻的前翅和后翅做数字化标点,获得翅的形态信息。经主成分分析(PCA)和薄片样条法(TPS)获得雌雄性在翅型和翅脉上的差异性。【结果】PCA结果表明,黄蜻雌雄性的前翅和后翅在翅型、翅脉结构上存在着明显差异,而且后翅间的差异更大。经TPS分析可知,雌雄性黄蜻前翅上的差异部位主要发生在亚翅结和三角室,后翅的差异部位主要发生在亚翅结、肘脉域和臀角区域。对黄蜻前后翅的大小分析(CS)可知,雌性黄蜻前后翅较大,雄性黄蜻前后翅较小。【结论】黄蜻雌雄性间的翅型结构差异性表明雌雄性在其各自生活史中履行不同的职责,特定的飞行模式逐渐形成特定的翅型、翅脉结构。