环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

埃博拉病毒扎伊尔亚型多引物自配引发等温扩增方法的建立

鉴于目前埃博拉疫情在西非流行和输入国内的潜在风险,开发快速准确易普及的检测埃博拉病毒的方法对埃博拉防控具有重大意义。本文拟建立一种基于颜色判定简单、快速和灵敏的方法,即多引物自配引发等温扩增技术(isothermal multiple self-matching initiated amplification,IMSA)应用于埃博拉病毒扎伊尔亚型的检测。该技术设计了分别对应于埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白(nuclear protein,NP)基因的7个区段的6条特异引物,在等温(63℃)条件下进行核酸扩增反应1小时,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色变化作为结果判定的标准。文中利用这种技术与RT-qPCR分别对含有目的片段的假病毒的系列稀释物以及模拟临床样本进行灵敏度分析,同时对30例健康人血浆以及登革病毒、日本脑炎病毒样本进行特异性分析。在塞拉利昂完成了81例埃博拉疑似病例血液样本的检测。结果显示RT-IMSA方法检测灵敏度与RT-qPCR方法的灵敏度相当,30例健康人血浆样本检测均为阴性,并且与登革病毒及日本脑炎病毒无交叉反应。与获得批准的荧光定量PCR试剂盒比较,RT-IMSA检测81例临床样本的结果为53例阳性,23例阴性,5例假阴性。灵敏度和特异性分别为91.4%和100%。因此,相较于RT-qPCR的高成本和复杂操作,RT-IMSA方法具有快速、简单的检测优势。