苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。     

黑龙江省苏云金杆菌的分离及对夜蛾科昆虫高毒力菌株的筛选

【目的】为了发掘新的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的资源,在黑龙江省不同地区采集不同类型的土壤样品分离出对夜蛾科具有高毒力的菌株。【方法】采用醋酸钠选择性筛选法筛选Bt菌株,利用10对通用引物对分离株进行基因型分析,SDS-PAGE进行杀虫晶体蛋白分析,同时测定苏云金杆菌分离株对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae(Linnaeus)、斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)的杀虫活性。【结果】从黑龙江省不同地区采集的352份不同类型的土壤样品中,共分离出46株苏云金芽孢杆菌野生菌株,出菌率为13.06%。油镜下可观察到伴孢晶体的形态有菱形、球形、镶嵌形及不规则形。结果表明产菱形晶体的菌株多含有cry1类基因,而同时产生菱形、球形及不规则形晶体的菌株则含有多种基因型。SDS-PAGE蛋白分析发现这些菌株主要表达130、90、60 ku蛋白。对其中的部分菌株进行毒力测定,结果表明有4株菌株对3种夜蛾科昆虫具有高毒力。【结论】黑龙江省苏云金芽孢杆菌分布广泛,类型多样,已获得对夜蛾科昆虫有高毒力的菌株,这对夜蛾科害虫的绿色防控及延缓其抗性具有重要意义。     

热应激和吡虫啉对大豆蚜hsp70和hsc70基因mRNA表达的影响

【目的】昆虫在高温或农药的胁迫下,通过高效表达热休克蛋白(HSP)等建立应激自我保护机制。本研究为从转录组水平上认识大豆蚜Aphis glycines在热应激和吡虫啉胁迫下hsp70和hsc70 mRNA表达分子机制,进而寻找自我保护应激反应中的薄弱环节,为大豆蚜的生物防治提供理论基础。【方法】采用同源克隆、RACE技术和实时荧光定量PCR等方法研究不同热激时间和热激后不同恢复时间及不同吡虫啉浓度对大豆蚜4龄若虫hsp70和hsc70的表达影响。【结果】37℃热激后,大豆蚜4龄若虫中hsp70表达量先上调,1 h时升至对照组的10.36倍（P<0.05）,然后逐渐下降。同样热激后恢复时间的长短对大豆蚜若蚜中hsp70的表达具有显著影响。热激处理后,大豆蚜若蚜中hsp70立即大量表达,表达量为对照组的8.78倍（P<0.05）,随后表达量下降至对照组水平,而hsc70的表达量并没有显著变化（P>0.05）。大豆蚜若蚜受吡虫啉的胁迫时,其hsp70和hsc70的表达量受吡虫啉的浓度及胁迫的时间的影响,呈现先升高后下降的趋势,具有明显的短期效应。【结论】吡虫啉诱导大豆蚜hsp70和hsc70表达量的上调;而热胁迫对hsp70和hsc70 mRNA具有不同的表达模式,高温可以诱导hsp70的表达,但对hsc70没有明显的诱导作用。     

中红侧沟茧蜂对不同龄期棉铃虫幼虫及其为害棉株的趋性反应

研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator Haliday对棉铃虫Helicoverpa armigera Hübner幼虫及其为害棉株的趋性行为, 可为高效应用中红侧沟茧蜂控制棉铃虫提供理论依据。本研究在实验室内以中红侧沟茧蜂雌蜂、1~5龄棉铃虫幼虫及其为害棉花植株（去虫或未去虫）为试验材料, 采用“Y”型昆虫嗅觉仪测定了中红侧沟茧蜂雌蜂对1~5龄棉铃虫幼虫及其为害棉株的趋性行为反应。结果表明: 中红侧沟茧蜂对3龄、4龄和5龄棉铃虫幼虫均没有明显的趋向行为反应, 1龄和2龄棉铃虫幼虫对中红侧沟茧蜂有显著的引诱作用。此外, 1~5龄棉铃虫幼虫为害后去虫棉株与健康棉株均对中红侧沟茧蜂有吸引作用。在未去虫的处理中, 虫害诱导棉株比健康植株更能吸引中红侧沟茧蜂, 与健康植株差异显著, 而且不同龄期棉铃虫幼虫为害处理间差异较大, 对中红侧沟茧蜂引诱作用的相对顺序为: 5龄为害植株>2龄和4龄为害植株>1龄和3龄为害植株 (2龄和4龄为害处理间差异不显著; 1龄和3龄为害处理间差异不显著)。本研究结果可为中红侧沟茧蜂在生物防治上的应用提供一定的理论指导和实践依据。     

大豆食心虫触角感器的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察了大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumura成虫的触角感器的形态和分布。结果表明,大豆食心虫成虫触角呈线型,感器包括毛型感器、耳型感器、刺型感器、腔锥型感器、栓锥形感器、鳞型感器和Bhm氏鬃毛,共7种。雌雄个体之间触角感器的分布特点基本相同,但是种类、数量有差异,存在性二型现象。     

致死中浓度溴氰菊酯对茄无网蚜体内能源物质的影响

【目的】通过LC_(50)溴氰菊酯胁迫1龄茄无网蚜Acyrthosiphon solani测定对其生长发育及能源物质的影响,为研究茄无网蚜抗药性产生提供理论基础。【方法】通过浸渍法用LC_(50)溴氰菊酯处理1龄茄无网蚜,间隔12h观测药剂胁迫后试虫的生长历期,分别用蒽酮法、考马斯亮蓝G-250法,香草醛试剂测定各虫龄试虫蛋白、糖类和总脂质含量并进行数据分析。【结果】药剂胁迫下显著延长了1龄(1.44倍)、2龄(1.26倍)的发育历期(P 0.05);蛋白质比重在2龄(0.75倍)、3龄(0.69倍)、成蚜(1.17倍)有显著差异(P 0.05),其他虫龄有差异但不显著;可溶性糖比重在2龄(1.39倍)差异显著(P 0.05);糖原比重在1龄(3.81倍)、2龄(3.82倍)差异显著;总脂质在1-4龄均有显著差异(P 0.05),分别是对照组的2.04、1.34、1.25、1.30倍。【结论】药剂胁迫对茄无网蚜的生长发育及各虫龄能源物质比重均有不同程度的影响。     

气候变暖对寒地大豆作物两种害虫发生的影响

【目的】研究温度上升对中国寒地大豆作物上植食性害虫种群发生及种间关系的影响,有利于做好田间多种害虫发生的长期预测预报。【方法】本研究在人工气候箱内模拟气候变暖,调查了低温和高温对大豆蚜Aphis glycines(Matsumura)及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)种群在大豆植株上的发生及二者种间关系的影响;并用"叶子圆片法"测试了两种害虫在不同大豆品种上共同发生时的相互作用影响。【结果】低温有利于大豆蚜种群发展,高温有利于朱砂叶螨的种群发生;在高温下,两种害虫的种间竞争系数下降,即环境容纳量会增大。另外,在现有的气温条件下,两种害虫在大豆上的发生关系是"偏利共存",易于共同发生的,特别是大豆蚜更易于成灾,尤其是一些感虫性比较高的当地主栽大豆品种,即不同大豆品种的抗虫性有显著差异。【结论】这些情况表明:当前寒地大豆作物上不甚严重的几种害虫在未来有较高的成灾风险,需要准备一些防控预案,譬如,选育一些抗虫性较高而又适宜本地栽种的大豆品种。     

寄主植物与温度对大豆食心虫滞育期间糖类和脂质含量的影响

【目的】本文探究了大豆食心虫Leguminirora glycinioorella(Mats.)Obraztsov进入滞育以后体内糖类、脂质和水分含量的变化,以及不同寄主植物和滞育诱导期温度对大豆食心虫体内糖类、脂质和水分含量的影响。【方法】通过蒽酮硫酸法和氯仿甲醇分离法测定了滞育前后、以大豆Glycine max(L.)Merr和野大豆Glycine soja Sieb.et Zucc.两种植物为寄主以及不同滞育诱导温度下的大豆食心虫体内脂质、水分、总糖、糖原和海藻糖的含量,结果利用SPSS17.0数据分析软件进行分析。【结果】进入滞育阶段的大豆食心虫体内脂质、总糖、海藻糖和糖原含量显著增加,含水量显著下降。以大豆为寄主的大豆食心虫在滞育阶段体内水分含量、总糖和糖原含量较野大豆寄主的高,海藻糖含量较野大豆的低,差异均显著。不同滞育诱导温度下的大豆食心虫体内生化物质含量基本一致。【结论】滞育前后大豆食心虫体内各种生化物质变化明显,以栽培大豆为寄主和以野大豆为寄主的大豆食心虫体内生化物质含量不同,而滞育诱导温度对大豆食心虫体内生化物质含量影响不大。     

性诱剂、赤眼蜂和化学药剂协同防治大豆食心虫的研究

【目的】本文为优化大豆食心虫Leguminirora glycinioorella(Mats.)Obraztsov生物防治策略,探究不同防治策略的最佳防治时期和最佳使用量,最终达到提高防治效率及保护环境的目的。【方法】选取哈尔滨和黑河两个地区进行试验,通过比较不同措施防治大豆食心虫的防治效果,以及在大豆食心虫不同发生期单独使用性诱剂和性诱剂-赤眼蜂协同防治的防治效果,寻找最佳防治方法及最佳防治时期。通过比较在不同配比下性诱剂与化学药剂(敌敌畏)协同防治效果,寻找最适配比。【结果】结果表明:(1)性诱剂-赤眼蜂协同防治效果为60.89%,明显优于单独使用性诱剂或赤眼蜂单独防治大豆食心虫。(2)性诱剂单独使用和性诱剂赤眼蜂协同防治大豆食心虫最佳防治时期都为其盛发期前5 d,防治效果最高可达62.42%和66.08%,其次是盛发期防治,盛发期后5 d防治效果最差。(3)性诱剂-化学药剂协同防治研究发现,从防治效果、经济效益、生态保护等多方面考虑,放每667 m2放1个诱捕器和3/4药量的敌敌畏熏蒸剂效果更佳,与使用化学药剂防治效果差差异不显著,并能减少农药使用量。【结论】研究结果表明,最佳生物防治策略为在大豆食心虫盛发期前5 d利用性诱剂-赤眼蜂协同防治大豆食心虫,每667 m2放1个诱捕器和3/4药量的敌敌畏熏蒸剂,可作为从化学防治向生物防治过渡的防治方法。     

东北地区草地螟1999年大发生的虫源分析

草地螟是我国北方重要的迁飞性害虫,对其虫源地及迁飞路线尚缺乏全面的认识。本文分析了1999年各地草地螟主要迁入峰期的天气学背景,并对风场的时空分布及草地螟迁飞轨迹进行了模拟。结果表明：1999年东北地区大发生的草地螟只有少部分来自以往认为的“主要发生基地”,其主要虫源来自蒙古共和国东部及中蒙边境地区;草地螟盛发期东北地区气旋性天气系统对草地螟的迁入和扩散有密切的关系,据此提出可将“东北低压”、“东北低涡”的发生、发展趋势与虫源地的情况结合起来作为监测草地螟迁入的预警指标。