苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。     

苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

【目的】从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOX)基因cDNA序列,并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术,扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体p ET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化,再利用梯度透析法进行复性,以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】该cDNA序列有2 154个碱基,开放阅读框1 824个碱基,编码607个氨基酸组成的多肽,分子量为67.04 ku,多肽的等电点为5.13。该序列命名为Hv GOX,在Gen Bank的登录号为KT907054。序列分析表明,Hv GOX的氨基酸序列与其他昆虫的GOX氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有m RNA水平的特异表达,其中在唾腺中的表达量最高;同时用0.01%、0.1%、1%和10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫,幼虫体内的GOX的表达均被诱导,且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因,该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。     

草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达

促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序列含有823个碱基,包括1个681个碱基的开放阅读框,编码1个含226个氨基酸的蛋白,分子量约为26.3 kD,等电点为8.51。序列分析表明,苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的PTTH高度同源。获得的基因已登录GenBank,登录号为JF731347。利用原核表达载体pET21b在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾PTTH基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化。     

沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因GdSP的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin-FA72的克隆、表达及功能验证

【目的】本研究旨在对光滑鳖甲Anatolica polita borealis丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆及表达分析,以验证光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能。【方法】利用PCR和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本性质进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树;构建光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白重组表达载体,表达、纯化蛋白进行功能验证。【结果】获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Ap Serpin-FA72(Gen Bank登录号:MF188125),其基因编码序列长为1 176 bp,编码由391个氨基酸残基组成的多肽,蛋白理论分子量为43.7 k D,理论等电点为5.14,包含一个由21个氨基酸组成的信号肽。As Serpin-FA72属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有胁迫应答的功能,与赤拟谷盗Triboloum castaneum Serpin的同源性最高。纯化得到的融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72大小约为63.7 k D。功能验证表明,重组蛋白Trx A-Ap SerpinFA72对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性均有抑制作用。【结论】光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达产物对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性具有抑制作用,表明其可能对消化类丝氨酸蛋白酶活性起抑制作用,对其功能活性的验证有助于深入研究Ap Serpin-FA72与丝氨酸蛋白酶之间的关系。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

小菜蛾气味受体蛋白PlxyOr83b基因的克隆及表达

【目的】克隆小菜蛾Plutella xyostella气味受体Or83b基因, 并进行原核表达, 为研究小菜蛾寄主选择行为的分子机理, 开发昆虫行为调节剂提供基础。【方法】提取小菜蛾的总RNA, 反转录获得总cDNA, 采用RT-PCR方法扩增目的基因, 将其克隆至T载体并测序, 然后将目的基因克隆到大肠杆菌Escherichia coli表达载体pET-32a (+)中表达。经酶切、 PCR及测序鉴定正确后转化BL21 (DE3)菌株, 用IPTG诱导表达, 通过SDS-PAGE, Western印迹鉴定表达蛋白。【结果】获得了编码小菜蛾Or83b的cDNA序列, 该基因阅读框长1 413 bp, 编码471个氨基酸, 预测的等电点为7.19, 命名为PlxyOr83b（GenBank登录号为GQ923610）; 成功构建了pET-PlxyOr83b原核表达重组质粒, 目的基因获得高效表达, 其融合蛋白分子量为32.0 kD, Western blot 检测结果进一步表明PlxyOr83b在大肠杆菌DE3中得到正确表达。【结论】成功克隆和表达了小菜蛾气味受体基因PlxyOr83b, 该基因与其他昆虫Or83b基因基本一致。     

鸽β-防御素1基因的克隆及其生物学作用鉴定

【目的】从鸽子组织中克隆鸽子β-防御素1(AvBD1)基因,在大肠杆菌中表达重组鸽子AvBD1蛋白,测定其生物学特性。【方法】应用RT-PCR法从鸽子骨髓组织中扩增鸽子AvBD1基因,采用Real-time PCR法检测该基因在鸽子组织器官中的表达分布。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProEX-HTa的EcoR I和Xho I双酶切位点上,构建重组表达质粒pProEX-pigeon AvBD1,将重组质粒进行诱导表达;对该重组蛋白进行纯化,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸,经序列相似性分析,鸽子AvBD1与鸭AvBD1氨基酸序列相似性最高(81.5%)。鸽子AvBD1主要分布于免疫系统和消化系统组织中。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明,重组鸽子AvBD1蛋白分子量约8.8 kD,与预期大小一致。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性。此外,该重组蛋白的溶血活性极低。【结论】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其主要分布在机体的免疫系统和消化系统中。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低。     

A serine protease in the midgut of the silkworm,Bombyx mori: Protein sequencing,identification of cDNA,demonstration of its synthesis as zymogen form and activation during midgut remodeling

We identified a serine protease with a molecular mass of 37 kDa in the midgut of the silkworm, Bombyx mori. The activity of this protease (37-kDa protease: p37k) appears after pupation, when the metamorphic remodeling of the midgut is under progress. The sequence analysis of the purified protease and its cDNA revealed that p37k is a trypsin-type serine protease, which is highly similar to serine proteases of other insects, including CG4386 of Drosophila melanogaster. In our molecular phylogenetic analysis, these proteases are grouped together with CG4386-like serine proteases of other insects to form an isolated cluster. The p37k protein and its putative orthologs present in this cluster have two unique sequence motifs, CxxCxC and FIDWLxxLLG, in the N-terminal side of the catalytic region. The gene for p37k is expressed in the midgut on day 2 of the silk-spinning larva, and the p37k polypeptide becomes detectable with a specific antibody at this stage of the midgut. On the other hand, p37k activity is not detectable until pupation, indicating that p37k is present in the larval midgut as an inactive precursor, which then is activated after pupation. A recombinant p37k produced using a baculovirus system is also inactive in its intact form. However, the recombinant p37k can be converted to an active protease when incubated in the homogenate of the midgut, suggesting that some unidentified midgut factor(s) are involved in the activation of p37k.     

Gene cloning and expression of cadherin in midgut of Helicoverpa armigera and its Cry1A binding region

Bacillus thuringiensis (Bt), a Gram-positive bacte-rium, produces insecticidal crystal proteins during sporulation. Bt has been used as biopesticides to con-trol a number of insect pests from Lepidoptera, Dip-tera and Hymenoptera and also has become so far the leading gene sources of transgenic plants resistant toinsect pests[1,2]. In China, the use of Bt cotton began in 1997 in Hebei, Shandong and Henan provinces, etc. and rapidly increased to more than 2 million ha in 2002, which is effe…     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛,挑选的44个克隆中有37个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对13个克隆进行序列测定,得到6种序列,它们在氨基酸组成上存在明显偏性,富含组氨酸和色氨酸,缺乏酸性氨基酸;6种序列存在一个共有序列。     

Expression and purification of the mitochondrial serine protease LACTB as an N-terminal GST fusion protein in Escherichia coli

LACTB is a mammalian mitochondrial protein sharing sequence similarity to the beta-lactamase/penicillin-binding protein family of serine proteases that are involved in bacterial cell wall metabolism. The physiological role of LACTB is unclear. In this study we have subcloned the cDNA of mouse LACTB (mLACTB) and produced recombinant mLACTB protein in Escherichia coli. When mLACTB was expressed as an N-terminal GST fusion protein (GST-mLACTB), full-length GST-mLACTB protein was recovered by glutathione-agarose affinity chromatography as determined by MALDI-TOF mass spectrometry and immunoblotting. Expression of mLACTB as a C-terminal GST fusion protein or with either an N- or C-terminal His6-tag resulted in proteolytic degradation of the protein and we were not able to detect full-length mLACTB. Analysis of GST-mLACTB by Fourier transform infrared spectrometry revealed the presence of alpha-helices, beta-sheets and turns, consistent with a well-defined secondary structure. These results show that mLACTB can be expressed as a GST fusion protein in E. coli and suggest that GST-mLACTB was properly folded.     

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、 序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶, 为了了解该类酶的分子特性及功能, 本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库, 首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列, 命名为HoSP1（GenBank登录号为FJ573146）。序列分析表明, 该基因长902 bp, 开放阅读框（ORF）长783 bp, 编码260个氨基酸, 推测分子量和pI值分别为26.7 kDa和4.19, 不含有N-糖基化位点, 但在Thr₁₅₇处有一个O-糖基化位点, 含有6个保守的半胱氨酸残基, 组成3对二硫键, 对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现, 该酶具有组氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）、 丝氨酸（Ser）催化中心, 与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性, 其中与CzSP3的序列一致性最高, 为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后, 进行体外表达, 以BTEE为底物, 测得该酶的活力为0.0378 μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。