克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌比较基因组学分析揭示多复制子抗性质粒介导广泛的抗性基因传播

[目的] 研究克雷伯氏菌与多复制子抗性质粒间的关系,分析细菌携带多复制子质粒对抗生素环境的响应机制。[方法] 以2018-2020年分离的56株不同来源克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）分离株为研究对象,利用微量肉汤稀释法评估其多重耐药表型,对分离菌株进行全基因组测序（WGS）,通过细菌全基因组关联分析（BGWAS）技术和比较基因组学方法深入解析多复制子抗性质粒形成的机制。[结果] 耐药表型分析发现野生动物来源的菌株具有更广的耐药谱系,总体Klebsiella sp.对氨苄西林表现出很高的耐药率（80.36%）,尤其是马来穿山甲来源菌株对头孢类抗生素高度耐受,同时对氯霉素、左氧氟沙星和复方新诺明等药物耐受,基因组分析发现这些菌株携带了抗性质粒和更多的抗生素抗性基因。进一步对69个质粒序列分析,发现有28个质粒为多复制子质粒,主要携带bla_CTX-M-15、bla_CTX-M-14、bla_CTX-M-55、bla_OXA-1和bla_TEM-1等β-内酰胺酶基因。细菌携带质粒类型分析认为Klebsiella pneumoniae可能是多复制子质粒的重要宿主,质粒骨架与结构分析发现多复制子质粒多由2个或2个以上单个质粒融合而成,携带此类质粒的菌株不仅获得了更广的耐药表型,而且在全球传播扩散分布逐年增加,因此产生对抗生素环境更强的适应性。[结论] 多重耐药性细菌呈现的表型与携带的多复制子质粒有关,相比较下多复制子质粒比非多复制子质粒有更强的抗性基因携带能力,或许是细菌在强大的抗生素压力下产生的重要响应机制。本研究对于未来探索细菌抗性基因的传播扩散机制具有重要意义。     

五株克雷伯氏菌噬菌体的生物学特性及比较基因组学研究

【目的】耐药性克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌作为人类感染的重要病原,是临床治疗重要的挑战。本研究对多株克雷伯氏菌裂解性噬菌体的生物学特性和基因组特征进行比较分析,为其应用提供更多科学数据。【方法】使用双层平板法从人类和动物新鲜粪便、污水中分离纯化裂解性克雷伯氏菌噬菌体;通过磷钨酸染色和透射电镜观察其形态;采用双层平板噬菌斑法确定其宿主范围,测定温度和pH稳定性、一步生长曲线和体外抑菌效果等生物学特性;基于全基因组测序对分离株进行比较基因组学分析;通过体内抑菌试验评估噬菌体对多重耐药变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) BS375-3感染的大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫的保护作用。【结果】5株噬菌体分别属于Schitoviridae (pKP-BM327-1.2)、Autographiviridae (pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKV-BS375-3.1)、Drexlerviridae (pKP-BS317-1.1)家族;噬菌体pKV-BS375-3.1可裂解受试菌中的8株,pKP-BM327-1.2可裂解受试菌中的3株,pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKP-BS317-1.1则分别裂解受试菌中的1株;5株噬菌体感染10-20 min后即进入指数增长期,在-20-37 ℃、pH 6-10环境下均能够保持稳定活性;感染变栖克雷伯氏菌BS375-3后经噬菌体pKV-BS375-3.1处理[感染复数(multiplicity of infection, MOI)=100]的大蜡螟幼虫96 h内存活率达到80% (8/10);5株噬菌体基因组长度在42-77 kb之间,未携带抗生素抗性基因和毒力基因,基于内溶素(endolysin)的溯源分析显示该蛋白在克雷伯氏菌噬菌体中呈现多样性,属内呈保守性。【结论】5株克雷伯氏菌噬菌体均具有较好的体外抑菌活性,生物学特性稳定,endolysin在噬菌体属内呈现保守性。宿主谱宽、潜伏期短的噬菌体pKV-BS375-3.1在治疗Klebsiella pneumoniae和K. variicola临床感染方面具有潜在应用前景。     

气候变暖对寒地大豆作物两种害虫发生的影响

【目的】研究温度上升对中国寒地大豆作物上植食性害虫种群发生及种间关系的影响,有利于做好田间多种害虫发生的长期预测预报。【方法】本研究在人工气候箱内模拟气候变暖,调查了低温和高温对大豆蚜Aphis glycines(Matsumura)及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)种群在大豆植株上的发生及二者种间关系的影响;并用"叶子圆片法"测试了两种害虫在不同大豆品种上共同发生时的相互作用影响。【结果】低温有利于大豆蚜种群发展,高温有利于朱砂叶螨的种群发生;在高温下,两种害虫的种间竞争系数下降,即环境容纳量会增大。另外,在现有的气温条件下,两种害虫在大豆上的发生关系是"偏利共存",易于共同发生的,特别是大豆蚜更易于成灾,尤其是一些感虫性比较高的当地主栽大豆品种,即不同大豆品种的抗虫性有显著差异。【结论】这些情况表明:当前寒地大豆作物上不甚严重的几种害虫在未来有较高的成灾风险,需要准备一些防控预案,譬如,选育一些抗虫性较高而又适宜本地栽种的大豆品种。     

野生鸟类分离的多重耐药肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)耐药基因分子进化特征研究

【目的】调查野生鸟类携带菌的耐药状况,探索其在细菌耐药性传播过程中的作用。【方法】从野生鸟类石鸡、绯胸鹦鹉、太阳锥尾鹦鹉和黑领椋鸟的新鲜粪便分离4株Klebsiella pneumoniae,采用微量肉汤稀释法评估其多重耐药表型,并利用全基因组测序技术和细菌全因组关联分析、比较基因组学方法对分离株进行分子溯源,系统解析其携带的多重耐药质粒或基因与其宿主、同源质粒间的关联。【结果】4株肺炎克雷伯菌的耐药谱各不相同,来自石鸡样本的分离株S90-2对9种药物耐受,绯胸鹦鹉样本分离株S141对3种药物耐受,太阳锥尾鹦鹉分离株M911-1仅耐受氨苄西林,黑领椋鸟的样本分离株S130-1对所使用的14种药物完全敏感。S90-2属于ST629型,携带bla_CTX-M-14、fosA6、aac(3)-Iid和bla_SHV-11为主的30个耐药基因和携带1个耐药性质粒pS90-2.3 (IncR型)。S141属于ST1662型,携带fosA5、bla_SHV-217等27个耐药基因,1个质粒pS141.1 [IncFIB(K)(pCAV1099-114)/repB型]仅携带耐药基因adeF。M911-1为新ST类型,携带bla_SHV-1、fosA6等共计27个耐药基因,其质粒pM911-1.1携带了3个耐药基因。S130-1属于ST3753型,携带bla_SHV-11、fosA6等27个耐药基因,pS130-1 [IncFIB(K)型]则仅携带一个耐药基因tet(A)。质粒比对表明,质粒pS90-2.3携带的耐药基因片段源自不同的肠杆菌科菌株染色体或质粒。pS90-2.3的同源质粒主要来自人类宿主菌,且主要在中国分布,这些质粒主要细菌宿主为K. pneumoniae和Escherichia coli,且ST11型K. pneumoniae分离株为重要宿主菌。【结论】本研究中来自野生鸟类的多重耐药K. pneumoniae,其耐药基因主要来自质粒,质粒耐药基因主要由转座子、插入序列、整合子和前噬菌体等可移动元件介导,这些多重耐药质粒与人类的宿主菌密切相关。