枯草杆菌蛋白酶基因工程的研究进展

本文介绍了枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)的研究现状,即利用定位诱变和体外重组等技术改变酶的性质,包括催化活性、底物特异性、稳定性、低温适应性以及酶在有机相中的性能等。对枯草杆菌蛋白酶的成功改造不仅有可观的商业价值,而且为蛋白质工程的发展作出了重要的贡献 。     

3-羟基丙酸高产菌株的筛选及诱变选育

【目的】3-羟基丙酸是一种重要的化学平台化合物,期望得到一株能够高产3-羟基丙酸的菌株。【方法】从土壤及粪便筛选并对得到的菌株进行鉴定和复合诱变。【结果】得到了一株能够利用丙酸发酵生产3-羟基丙酸的酵母Y-11,经生理生化鉴定及18S rDNA序列分析确定其为Candida sp.(假丝酵母)。以Y-11为出发菌株,经紫外-亚硝基胍-60Coγ复合诱变得到了突变性状稳定且可遗传的高产菌株5-13B,其3-羟基丙酸的产量为11.78 g/L,是出发菌株的2.46倍。【结论】对出发菌株和突变株的发酵特性进行了比较,结果表明突变株的3-羟基丙酸产量、对底物丙酸的转化率、产物3-羟基丙酸的积累性能及丙酸的耐受性均优于出发菌株。     

Neurospora crassa phytase功能区基因phy A''的克隆表达及活性变化

目的:检测N.crassa phtase功能区基因phy A′表达的Phy A′活性变化。方法:先将N.crassa phy A′克隆到表达载体pPIC9K中,然后将获得的重组质粒pPIC9K-phy′转化到毕赤氏酵母中分泌表达,分离纯化重组酶Phy A′,并测定其酶学性质。结果:与原酶相比,N.crassa Phy A′的最适温度降低、热稳定性降低以及酶活力的降低。结论:N.crassa phtase N端的前12个氨基酸对维持该酶的功能有比较重要的作用。     

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。     

Neurospora crassa phytase功能区基因phy A＇的克隆表达及活性变化

目的：检测N.crassa phtase功能区基因phy A′表达的Phy A′活性变化。方法：先将N.crassa phy A′克隆到表达载体pPIC9K中,然后将获得的重组质粒pPIC9K-phy′转化到毕赤氏酵母中分泌表达,分离纯化重组酶Phy A′,并测定其酶学性质。结果：与原酶相比,N.crassa Phy A′的最适温度降低、热稳定性降低以及酶活力的降低。结论：N.crassa phtase N端的前12个氨基酸对维持该酶的功能有比较重要的作用。     

以Zeocin抗性基因为选择标记的Candida glycerinogenes遗传转化

为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeocin抗生素对C.glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C.glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）,但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。     

1,3-丙二醇产生菌的诱变育种及培养基优化

以实验室自然筛选的克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)为出发株,采用紫外诱变及亚硝基胍和超声波协同处理获得一株1,3-丙二醇高产突变株。在摇瓶发酵中,其产1,3-丙二醇产量由17.39 g/L提高到24.11 g/L,提高38.64%。变异株经10次传代培养,发酵能力稳定。对发酵培养基成分进行了优化,优化后1,3-丙二醇产量为30.05g/L,为优化前的1.25倍。     

可改良棉粕蛋白的菌株选育及其发酵

棉粕蛋白质含量高达38％~50％,然而作为饲料其蛋白质品质较差,饲料利用率较低。为提高其蛋白质利用率,从自然界筛选出了能够高效降解棉粕大分子蛋白质的优良菌株4株,经生化与分子生物学试验鉴定为Bacillus subtilis(2株,编号为H1和H7),Bacillus cereus (1株,编号为H9)和Aspergillus niger (1株,编号为P1)。通过单菌及组合发酵实验比较发现:最适宜菌种组合为B. subtilis(H1)和A. niger (P1)。两菌株组合发酵后,棉粕TCA-NSI(三氯乙酸氮溶指数)提高了25.34%,小分子多肽含量提高了11%,游离必需氨基酸提高了24%,蛋白质的体外消化率由44.56%提高到了78.61%,明显高于其他菌种组合,研究结果表明其组合发酵可有效改良棉粕蛋白品质,显著提高棉粕蛋白的饲用价值。     

白腐菌对染料脱色和降解作用的研究进展

白腐菌应用于废水处理始于二十世纪八十年代。本文对印染废水的处理方法、白腐菌及其对污染物的降解机理作了简要概述 ,着重介绍了白腐菌对染料脱色和降解作用的研究进展。白腐菌对染料的脱色解降作用机理有部分尚待进一步研究 ;同时 ,白腐菌的吸附作用亦不容忽视。