肽类毒素(蜘蛛、蝎、芋螺)的三维结构

多肽类毒素研究是目前毒素研究的一个重点,对多肽类毒素的三维结构的研究是了解其结构与功能关系的重要基础.对蜘蛛、蝎以及芋螺这3类代表性的有毒动物的多肽类毒素在结构研究方面的进展及其三维结构的特点进行了介绍.其中,蜘蛛毒素多肽分子的结构主要发现有ICK模体(Inhibitor Cystine Knot motif)和D DH模体(disulfided-irectedh-airpin)两类,蝎毒素中长链肽类毒素分子和短链肽类毒素分子的结构明显不同,前者以CSα/β结构模体(Cyss-tabilizedα/βfold m otif)为主,后者则以α/β脚手架结构模体(α/βscaffoldm otif)为主.相对于蜘蛛和蝎而言,芋螺肽类毒素分子的三维结构则表现得更为复杂多样.     

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3（mussel foot protein-3, mfp-3）是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/ Mfp-3.经IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平（quartz crystal microbalance,QCM）分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA) 含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.     

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术（shotgun-LC-MS/MS）对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱（LTQ）进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图（MS/MS）用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签（expressed sequence tag,EST）数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础.     

外套膜转录物组分析揭示尿素在贻贝耐受海水酸化中的作用

海洋酸化是目前地球面临的主要环境问题之一,对海洋矿化生物的生存带来严重威胁。贝类是目前海水养殖的主要物种,海洋酸化会对贝壳的生物矿化过程产生抑制,因而对贝类养殖业的发展带来严重影响。前期研究中已发现,尿素对贻贝贝壳的形成具有辅助作用,推测尿素有助于贻贝在海洋酸化背景下的生存。为进一步探究尿素通过何种分子机制对贻贝耐受海洋酸化产生积极影响,以厚壳贻贝外套膜为研究对象,采用转录物组学策略分析了尿素添加对贻贝外套膜组织在酸化海水中的基因表达量变化的影响。结果表明,尿素添加对贻贝外套膜在酸化条件下的转录物组变化具有逆转趋势,可抑制外套膜中受酸化胁迫而激活的细胞自噬、凋亡、以及免疫应激相关通路;同时,也诱导了部分贝壳基质蛋白质表达量的上调,从而有助于维持贻贝在酸化条件下的生物矿化过程。上述研究有助于了解贻贝对海洋酸化的耐受性机制,也为后续贝类养殖业在海洋酸化背景下的健康发展提供了新的思路。     

金黄杆菌ZHDP1菌株基因组分析及其蛋白酶活性特征与产酶优化

【背景】蛋白酶活性研究对于理解金黄杆菌属（Chryseobacterium）菌株的生态角色、工业价值及潜在致病机理十分重要。【目的】分析一株细菌的新型基因组序列,以此推断其中潜在的蛋白酶基因,并对其蛋白酶活性进行验证与优化,为后续研究提供数据支撑。【方法】利用高通量测序技术对菌株基因组序列进行测定与组装,并利用单因素优化方法对菌株的蛋白酶作用条件与产酶条件进行优化。【结果】分离得到一株蛋白酶活性菌株,通过分子生物学手段鉴定为金黄杆菌属菌株,并命名为Chryseobacterium sp. ZHDP1。该菌株基因组大小为4 917 748 bp,GC含量为35.95%,平均核苷酸相似性和DNA-DNA杂交指数分别为91.39和47.8。该菌株基因组中发现超过20条蛋白酶基因,上清液中也检测到蛋白酶活性,其最适反应温度和pH值分别为50℃和7.0。Zn²⁺、Mn²⁺和Cr₂O₇^2-对蛋白酶活性有强烈抑制作用。ZHDP1菌株在培养温度35℃、培养时间35 h、接种量4%、碳源和氮源为...     

厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的初步鉴定(英文)

足丝蛋白是贻贝科(Mytilidae)所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白,也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部沿海,是我国具有重要经济价值的贻贝,其足丝粗硬,黏附力强,关于厚壳贻贝的足丝蛋白的研究目前尚未见报道。通过醋酸抽提结合反相高效液相色谱分离,从厚壳贻贝足丝盘中分离纯化到数种低分子量足丝蛋白,经质谱鉴定和氨基酸序列测定,其中三种足丝蛋白(分子量6 kD左右)属于贻贝足丝蛋白-3(mytilus foot protein-3,mfp-3)家族,且序列中富含DOPA,另有三种足丝蛋白为未知新型足丝蛋白。石英晶体微天平分析表明,厚壳贻贝低分子量足丝蛋白在金表面有较强的吸附能力,这与其黏附功能是直接相关的。以上工作为深入了解厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的分子多样性以及黏附机制奠定了基础。     

厚壳贻贝Mytilus coruscus足丝盘及足丝的多巴分析

多巴(3,4-1-dihydroxyphenylalanine,DOPA)是贻贝足丝粘附蛋白中的一种特殊的氨基酸,由酪氨酸经羟化后生成,与贻贝足丝粘附蛋白的强粘附性能具有直接联系.目前,已鉴定的多种贻贝足丝蛋白序列中均发现有不同含量的DOPA存在.蛋白中DOPA的定量检测对于了解DOPA在蛋白粘附中的作用以及粘附蛋白的...     

基于illumina测序的厚壳贻贝足组织转录组研究

贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点．为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足组织进行转录组测序,首次构建了厚壳贻贝足组织的转录组数据库．共计获得7 199 799 840 nt的碱基数据经过序列拼接和组装,获得88 825条unigene．对上述unigene开展了序列注释,共计37 007条unigene获得注释．在此基础上,经序列检索和比对,从中筛选出与目前已知的11种足丝蛋白同源的56条unigene序列并进行分析．结果表明,厚壳贻贝足丝蛋白具有明显的氨基酸偏好性,部分足丝蛋白具有重复序列,且厚壳贻贝足丝蛋白与其他种类的贻贝足丝蛋白具有较高的序列相似性．上述结果为后续贻贝足丝蛋白的批量鉴定以及在此基础上的贻贝足丝形成、固化以及粘附机制相关研究奠定了基础．     

利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签（EST) 数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.     

基于厚壳贻贝Mytilin-1的抗菌肽设计、固相合成及抗菌谱分析

贻贝抗菌肽Mytilin是贻贝免疫系统的重要组成部分,对其结构与功能的研究表明,其序列中连接两段β-折叠的发夹区域是其抗菌功能的关键所在。为验证该区域是否具有抗菌活性,通过对厚壳贻贝Mytilus coruscus抗菌肽Mytilin进行空间结构模拟,选取其中β-发夹部分肽段,采用了固相化学合成的方法合成了两条10肽,分别命名为Mytilin Derived Peptide-1(MDP-1)和Mytilin Derived Peptide-2(MDP-2)。高效液相色谱以及质谱检测结果表明,合成是成功的。抗菌谱研究表明,MDP-1和MDP-2对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均具有明显的抑制作用,同时,合成的MDP由于序列短且有两对二硫键,因此对于温度及人血浆均表现出很强的稳定性。上述研究结果为深入了解厚壳贻贝抗菌肽Mytilin的抗菌机制以及在此基础上开发具有应用价值的新型抗菌肽奠定了基础。