厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3（mussel foot protein-3, mfp-3）是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/ Mfp-3.经IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平（quartz crystal microbalance,QCM）分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA) 含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.     

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术（shotgun-LC-MS/MS）对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱（LTQ）进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图（MS/MS）用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签（expressed sequence tag,EST）数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础.     

利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签（EST) 数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.     

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域（Chitin-biding domain）,因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。