人淋巴细胞的体外抗体诱发及其在杂交瘤中的应用

本文应用手术切除的人扁桃体或外伤脾为材料,在体外诱发了针对不同类型抗原的抗体应答,其中包括羊红细胞、卵白蛋白、破伤风类毒素和乙肝病毒表面抗原的抗体应答,并应用破伤风类毒素体外激活的人B淋巴细胞制作杂交瘤。根据多次融合的结果表明其融合率平均为52.1%,抗体阳性率为15.6%,分泌IgM和IgG抗体的阳性集落孔的比例接近1∶1。我们还研究了体外诱发人淋巴细胞产生抗体的条件,发现细胞类群(在本研究中是采用不同的细胞分离方法)是主要的影响因素,值得进一步研究。目前所建立的体外免疫实验系统,主要是应用尼龙毛柱法富集B细胞,在96孔培养板上加上一定剂量范围的抗原刺激。为了协助淋巴细胞反应,可再加10%的T细胞条件培液或少量丝裂原混合物(LPS0.1μg/ml+PWM1μg/ml)。     

应用流式细胞仪定量评估人—鼠杂交瘤株细胞抗体生...

The paper described a method of quantitative stability analysis of antibody production by hybridoma clones with flow cytometry (FACS). Through FACS analysis the frequency of antibody-negative variants was measured. The rate of generation of antibody-negative variants/cell/generation (mu) could be calculated through Luria-Delbrück fluctuation analysis. The results showed that the value of mu was correlated to the antibody production of hybridoma clones: the larger was the mu value, the more unstable was the antibody production by the hybridoma clones. The experimental results suggested that the clone was stable if its mu value was on the magnitude of 10(-3), while the clone was not stable if its mu value was on the magnitude of 10(-2). According to requirements of single cell for FACS analysis and presence of a variety of methods for dispersing cell aggregates to single cells, the authors regard that this method is fully suitable for analysis of cells in suspension or even in the form of aggregate.     

用体外免疫的人淋巴细胞建立抗破伤风类毒素的杂交瘤克隆

我们应用破伤风类毒素体外免疫的人扁桃体细胞和人-鼠异源骨髓瘤RF 系细胞进行融合,从中筛选到一株杂交瘤细胞89112—50,并通过克隆化筛选获得了两个亚克隆,其分泌的抗体是抗原特异的,和三种抗原(OVA、TC-S、FYG)都不交叉,分泌抗体的功能也比较稳定,在培养瓶内连续扩增传代13次后,仍维持相当高的抗体分泌能力,在常规传代培养过程中所收集的培养物上清液中抗体的含量平均为69.6μg/ml。     

小鼠对天花粉蛋白体内及体外免疫应答的基本特点

C 57 BL/6 J小鼠在应用弗氏全佐剂或铝矾为佐剂结合天花粉蛋白免疫后都能引起抗原特异的IgE类抗体的反应以及其它Ig类抗体的反应;IgE的滴度和总的抗天花粉蛋白抗体的滴度的动态变化趋势基本一致,但并不完全同步。IgE类上升得较IgG等类抗体为慢,但上升的速度要快。脾和肠系膜淋巴结细胞分泌抗体的动态变化也和血清并不完全一致。天花粉蛋白在一定浓度下能抑制小鼠T淋巴细胞在体外的抗原特异的增殖反应和ConA反应。这抑制并不限于增殖过程的启动。补充外源性的IL-2也不能消除这抑制作用。天花粉蛋白加热变性后丧失了对小鼠淋巴细胞的毒性,并能引起经未变性天花粉蛋白体内致敏的小鼠的T淋巴细胞在体外的明显增殖。应用微量的天花粉蛋白为抗原,以及少量的无凝集素的conA条件培液等能在体外诱发致敏的B淋巴细胞产生二次抗体应答。     

应用流式细胞仪研究抗IL——8单抗对IL——8激活人颗粒细胞活力的中和作用

以ＩＬ－８免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾细胞与Ｓｐ２／０或６５３小鼠骨髓瘤细胞融合构建了淋巴细胞杂交瘤克隆Ｉ８－Ｓ２和Ｉ８－６３。ＥＬＩＳＡ叠加试验（ＥＬＩＳＡ Ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ Ｔｅｓｔ）表明这两杂交瘤克隆分泌的单抗分别识别ＩＬ－８分子的不同表位。ＩＬ－８能激活人颗粒细胞,引起细胞内Ｃａ＾２＋浓度（「Ｃａ＾２＋」）上升。通过流式细胞仪分析「Ｃａ＾２＋」的变化,发现两个克隆单抗对ＩＬ－８激活细胞的活     

体外诱发抗体生成过程中淋巴细胞的变化

为了了解体外抗体应答中T、B淋巴细胞的变化,以进一步阐明体外抗体应答的细胞学过程,并为完善体外免疫实验系统提供方向和依据,利用荧光激活细胞分选仪(FACS),在本实验室建立的人淋巴细胞体外免疫实验系统的基础上,对体外诱发抗体应答中淋巴细胞的变化进行了分析和研究,得到以下初步结果。一、T细胞所占比例的变化与设置培养物时细胞浓度相关,如果T细胞一开始占比例较大时,其变化为下降,否则其变化为上升。但最终都维持在30%上下。二、CD4~+(T辅助)细胞和CD8~+(T抑制)细胞的变化在扁桃体细胞和脾细胞中有所不同。在两周的培养过程中,前者无论加或不加C.M.(T细胞条件培液)或MTG(混合丝裂原),CD4~+细胞的比例均高于CD8~+细胞;而后者在加了C.M.或MTG后,CD8~+细胞的比例明显上升,但CD4~+细胞却有下降趋势。论文讨论了上述变化与免疫应答强度的可能关系。此外,亮氨酸甲酯(Leu-O-Me)的加入对CD8~+细胞没有影响。三、B淋巴细胞的变化,在培养两周过程中,无论扁桃体还是脾脏来源的细胞,B细胞富集的程度没有发生明显的变化,直至培养结束时,B细胞的比例仍维持在60%左右。T、B细胞间的比例也无明显变化,这表明所建立的体外免疫实验系统对B细胞的存活及其应答的诱发是适宜的。CD19~+B细胞的变化较为明显,其意义目前尚难推测。此外,一般认为CD5~+B细胞是一类分泌自身抗体的细胞,在培养过程中一直处于少数,未见增多。四、对于本实验中设置“框界”(“gating”)的合理性进行了讨论。     

小鼠抗天花粉蛋白IgE型单抗的酶解及其Fab的制备

研究了Ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备。Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ′）_２,分子量在１５０～１６０ｋＤ左右;经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ,分子量７２ｋＤ,可通过凝胶过滤获得纯的Ｆａｂ。而Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解物经ＤＴＴ还原、碘乙酰胺烷化虽然也可得到Ｆａｂ′（ｔ）,但不易纯化;可见,要制备Ｆａｂ以采用Ｐａｐａｉｎ裂解为好,而制备Ｆ（ａｂ′）_２则可采用Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解。这二个酶的裂解速度是Ｔｒｙｐｓｉｎ大于Ｐａｐａｉｎ。     

抗天花粉蛋白IgE单抗的抗独特型抗体及其鉴定

为了研究抗独特型抗体对天花粉蛋白特异的IgE反应的调节作用,建立了分泌针对天花粉蛋白的IgE单抗的独特型决定簇的大鼠-小鼠异种杂交瘤细胞株(6 C_5)。以分泌抗天花粉蛋白IgE单抗的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株(TE—1)诱生的腹水,通过免疫亲和层析,分离得到TE-1单抗免疫Wistar大鼠。将免疫大鼠脾细胞与小鼠骨髓细胞(NS-1)进行异种间细胞融合,通过严格的筛选和克隆化,最终得到3侏生长稳定、连续分泌抗体的异种杂交瘤细胞株(6 C_5、3 E_3和8 G_6),并能顺利地经受冰冻保种和复苏。用间接ELISA法对所获得的单抗进行鉴定,即比较三个单抗对下列包被抗原的反应性,其中包括TE-1(天花粉蛋白特异的IgE单抗)、3A 12(天花粉蛋白特异的IgA单抗)、ADNP和142(抗DNP IgE单抗,来自两个不同的杂交瘤株),以及M Ig(正常小鼠血清Ig)。结果表明6C_5单抗只与TE-1呈阳性反应,对其余各种包被抗原的反应均呈阴性,说明杂交瘤株6C_5具有抗TE-1单抗独特型决定簇的特异性,实验经多次重复,因此可以结论,成功地建立了一株能分泌抗独特型抗体的异种淋巴细胞杂交瘤株。此外,8G_6与所有包被抗原均呈强阳性,说明它具有抗各类小鼠Ig共同决定簇的特异性。3 E_3的特异性尚未最终确定。在方法学上的改进包括细胞融合时所用的HAT选择培液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的剂量较常量加倍,而氨基喋呤的剂量较常量减半。并且缩短在HAT培液中和HT培液中培养时间。这些可能为杂种淋巴细胞杂交瘤株的建立提供了有利条件。为了保证ELISA检测的特异性,作包被抗原的TE-1单抗与免疫大鼠用的TE-1单抗的来源不同,它来自无血清培养液培养的TE-1的上清液。同时,间接ELISA法所采用的酶联第二抗体(兔抗大鼠Ig),通过小鼠Ig的吸收等,证明其与小鼠Ig无交叉反应后才使用。     

用荧光激活细胞分选仪检测细胞存活的两种不同染色方法的比较

本文比较了用PI和FDA两种不同染料, 通过FACS来检测细胞的存活,表明两种不同染料所得结果均能正确反映细胞存活的情况,而且两者的结果是一致和稳定的。并讨论了这两种方法应用于FACS检测中的优点。     

瑞典Pharmacia公司在沪举办细胞生物学新技术讲习班

四月初,瑞典Pharmacia公司Oldentoff先生和Bartlett博士前来上海细胞生物学研究所举办细胞生物学新技术讲习班。沪、杭、宁、苏地区有关科研机构和高等院校的100名人员听了讲座,有54人观摩了示范实验并进行了实验操作。讲座内容包括:应用一种新的密度梯度介质Percoll分离细胞、细胞器、细菌及病毒细胞亲和层析方法;细胞学研究中Lectins和ProteinA的应用;Cytodexl应用于大量繁殖细胞等。瑞典外宾