含RGD受体结合位点口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株的拯救及初步鉴定

[目的]构建含有精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸(RGD)受体结合位点口蹄疫病毒(FmDV)Asial/JS/Chind2005株的全长感染性cDNA克隆.[方法]采用定点突变方法,构建Asial型FMDV含有预期突变的全长cDNA克隆pFMDV-RGD.pFMDV-RGD重组质粒经NotI线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒peDNATIP共转染BHK-21细胞,进行FMDV-RGD病毒拯救.[结果]序列测定结果表明成功构建了FMDV含有RGD受体位点的Asial/JS/China/2005全长cDNA克隆.共转染试验获得拯救病毒,对拯救的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,表明成功拯救了含有RGD受体结合位点的Asial/JS/China/2005株FMDV.[结论]该试验为进一步研究含有RGD和RDD受体结合位点2个拯救病毒生物学特性的差异奠定了基础.     

Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点多样性

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

不同长度poly(C)对口蹄疫病毒基因工程毒的毒力影响

【目的】研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV) poly(C)区段的序列长度与FMDV毒力之间的关系。【方法】首先利用NheⅠ/NotⅠ线化FMDV pGEM-XJ/AKT/69全长重组质粒,制备体外转录本,借助Lipofectamine 2000转染BHK-21细胞,获得基因工程毒。随后,在细胞传代过程中,收取不同代数病毒培养液,提取总RNA进行poly(C)的长度测定,并进行乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50的测定。【结果】我们发现,基因工程毒在BHK-21上连续传代至第6代时,可见明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);在经过一代乳鼠接种之后再重新适应到BHK-21细胞的过程中,poly(C)区段出现了缩短现象;乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50测定结果表明,尽管基因工程毒与母本毒相比毒力偏低,但含有不同长度poly(C)的基因工程毒之间并无显著差异。【结论】poly(C)区段的序列长度在12~17个C之间改变对FMDV基因工程毒的毒力无明显的影响。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

FMDV 3C蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点.本研究从Asia Ⅰ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBac B中,构建出重组转移载体pMel-3C.最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒.重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72 h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Western blot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别.本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础.     

一株O型口蹄疫病毒在C57BL/6小鼠和原代细胞的传代及其全序的测定和分析

【目的】旨在成功建立FMDVC57BL/6小鼠的实验感染模型。【方法】采用体内和体外循环适应传代的方法,选取一株对C57BL/6小鼠不敏感FMDVO/HK/CHA/99MF4,将其在C57BL/6小鼠(体内)和胎猪肾原代细胞FPK (体外)进行多次循环适应传代。【结果】成功获得一株对C57BL/6小鼠敏感的FMDVO/HK/CHA/99MF4C5株。【结论】本研究成功建立了FMDV突变株感染C57BL/6小鼠的实验动物模型,为未来FMD疫苗效力的评估和致病性相关的研究奠定了基础。     

分泌抗PRRSV抗体的猪源单克隆B细胞永生化方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的高度接触性传染疾病,对社会经济造成重大损失。目前并未获得有效的中和抗体应用于科研及治疗中,所以建立一种筛选具有中和活性的单克隆抗体的方法,对PRRSV防治及抗原位点筛选具有重要意义。单克隆抗体在人类和动物的众多疾病治疗及诊断中得到广泛应用,而针对不同病原如何筛选出有效的中和抗体是目前急需解决的问题。在单克隆抗体筛选的众多方法中,B细胞永生化方法是一种有效的且大概率能获得单克隆中和抗体的方法。通过将bcl-6和bcl-xl两个基因中间通过f2a序列连接后构建到一个载体上,进行逆转录病毒包装。包装成熟的逆转录病毒感染免疫PRRSV的猪源淋巴细胞,并使用加入CD40L和IL21细胞因子的完全培养基培养,然后使用CD21作为筛选标记通过磁珠法进行B细胞筛选,最后对筛选得到的B细胞单克隆化并进行检测,验证是否有抗体分泌。结果显示,构建的质粒不论单独转染还是与病毒包装时的两种质粒共同转染,均可以成功表达,且包装病毒可成功感染细胞。感染后的淋巴细胞可以检测到抗体分泌,进一步筛选得到的B细胞也可以检测到抗体分泌。因此,本研究成功建立了一种针对PRRSV的单克隆抗体筛选方法。     

嵌合O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性

【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDV O/GSLX/CHN/2010的S片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯救得到两株基因工程嵌合病毒rGDexc、rGZexc;进而从病毒复制和病毒对乳鼠的致病力方面,对嵌合病毒、亲本基因工程病毒以及FMDV O/GSLX/CHN/2010株进行了评价。【结果】FMDV O/GSLX/CHN/2010株复制较慢,对乳鼠致病力较差。嵌合病毒和亲本基因工程病毒的复制能力、对乳鼠的致病力明显高于FMDV O/GSLX/CHN/2010株。【结论】研究表明FMDV O/GSLX/CHN/2010的S片段不能独自决定该病毒较差的复制能力和较弱的乳鼠致病力。这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制以及S片段对病毒生物学特性的影响奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点多样性

【目的】口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)通过结构蛋白VP1 G-H环上高度保守的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)基序与整联蛋白结合起始病毒的感染,但FMDV是RNA病毒,在环境条件变化时,FMDV能够以非RGD的途径起始病毒的感染。为了研究FMDV Asia1/JS/China/05田间舌皮毒经两种不同的途径短期传代后细胞受体结合基序RGD的变异。【方法】采用RT-PCR方法扩增FMDV Asia1/JS/China/05田间毒、田间毒的乳鼠适应毒第四代(MF4)和接种田间毒的牛同居感染的猪水泡病料适应细胞的第八代毒(PBF8)结构蛋白VP1基因,并对不同病毒VP1基因的PCR产物测序和cDNA文库测序。【结果】以含RGD受体结合基序为优势的田间毒在乳鼠上短期传代后出现了含精氨酸-丝氨酸-天门冬氨酸(Arg-Ser-Asp,RSD)和RGD受体结合基序的混合种群,而同居感染后的细胞传代病毒种群则以含精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(Arg-Asp-Asp,RDD)受体结合基序为优势种群。【结论】发现了含RGD受体结合位点为优势的FMDV种群,经不同的宿主短期传代后产了含RSD或RDD受体结合基序的优势种群,该发现不仅增加了保守基序RGD发生替换的FMDV变异株的数量,而且为FMDV的细胞识别和宿主嗜性的改变等进一步研究奠定了物质基础。     

六盘山翠金小蜂生物学特性的研究

六盘山翠金小蜂Tritneptis sp.是华北落叶松人工林主要食叶害虫落叶松红腹叶蜂Pristiphora erichsonii Hartig茧期的体外复寄生性天敌。对该蜂的生物学特性研究表明,该蜂在宁夏六盘山1年2代,以幼虫在寄主茧内越冬,翌年4月中旬开始活动取食,5月中旬开始化蛹,成蜂从6月中旬开始羽化,每头虫茧平均出蜂6.14头,雌雄比1.79∶1,雌蜂6月下旬开始产卵,一只雌蜂一生可在12.2头寄主虫茧上产卵,第1代寄生蜂幼虫7月上旬开始孵化并吸食寄主营养发育,7月下旬开始化蛹,8月上旬开始羽化并交尾、产卵寄生。该蜂体型较大,对寄主跟随性强,无重寄生天敌,自然寄生率7.3%～33.6%,是一种优良天敌寄生蜂。