饲喂重组鸡白细胞介素18蛋白增加肉仔鸡体重的初步研究

经口服途径给肉仔鸡饲喂重组鸡白细胞介素 1 8(ChIL -1 8)蛋白,观察其在正常饲养条件下和人工感染鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)时对肉仔鸡的影响。将 84只肉仔鸡随机分为 2组:正常称重组和IBV接种组。 2组肉仔鸡再随机各分为 3个亚组,分别每隔 5d各口服 1次PBS、细菌蛋白和重组ChIL -1 8蛋白。正常称重组每亚组 8只,每次口服前称重。IBV接种试验组每亚组 2 0只,在 30日龄时滴鼻接种IBVM41株并每隔 5d称重 1次。各亚组试验鸡分别在正压隔离器中饲养。结果表明,饲喂重组ChIL- 1 8蛋白的试验亚组肉仔鸡体重总增重量明显高于饲喂PBS和细菌蛋白的对照亚组;IBV接种试验组肉仔鸡在人工感染IBVM41株后,饲喂重组ChIL 1 8亚组的发病率和死亡率明显低于饲喂PBS和细菌蛋白亚组,而且后 2个亚组肉仔鸡临床症状也较饲喂重组ChIL- 1 8试验亚组明显。结果初步显示,饲喂重组ChIL -1 8融合蛋白能够增加肉仔鸡体重并可增强肉仔鸡对IBV感染的抵抗能力。     

鹅细小病毒分离株HG5／82的分子特征分析

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较。结果表明:HG5/82 株非结构蛋白(Non structure, NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸。HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸。序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础。结构基因 VP3 间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性。HG5/82 与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性。     

带3蛋白C端和血型糖蛋白A相互作用及其抗原相关性的研究

采用高效液相色谱法分离鉴定了红细胞膜蛋白质跨膜域的亲水性肽链,结果显示血型糖蛋白A(GPA)Lys101～Asp130与带3蛋白有相关性.为进行深入研究,采用RT-PCR方法从K562细胞中扩增了410 bp的GPA基因,分别克隆到酵母双杂交BD端表达质粒和杆状病毒转移载体上.同时,以含有带3蛋白全长基因的质粒为模板扩增了348 bp的带3蛋白C端基因,将其克隆到酵母双杂交AD端表达质粒.经酵母双杂交营养缺陷培养选择和β半乳糖苷酶检测证实GPA与带3蛋白之间存在相互作用.GPA表达产物分别经抗带3蛋白和抗GPA抗体进行蛋白质印迹分析,表明二者具有免疫交叉反应.上述结果表明带3蛋白与GPA在结构与功能上存在着密切联系.     

拼接信号序列单碱基变异提高马传染性贫血病毒mRNA拼接效率

分别以马传染性贫血(马传贫)驴强毒(D—A EIAV)RNA和马传贫驴白细胞弱毒疫苗(DLA EIAV)RNA为模板,利用RT—PCR的方法,克隆到马传贫强、弱毒株基因组外显子2及其下游的核苷酸序列。然后将报告基因CAT插入到EIAV内含子2env阅读框架中,构成CAT拼接报告系统。同时在强毒株重组表达质粒的基础上,将其外显子-3上游拼接受体位点的核苷酸序列CAG突变为弱毒株相应位置的核苷酸序列TAG,得到强毒单核苷酸突变株重组表达质粒。用构建的3个重组表达质粒DNA转染驴血白细胞,ELISA检测转染细胞CAT浓度。结果表明：EIAV强毒株重组表达质粒中CAT蛋白表达量最高,EIAV强毒株重组表达质粒次之,EIAV强毒突变株重组表达质粒最低。由于CAT基因被插入于各重组质粒中的EIAV内含子-2里,EIAV外显子-2、3之间的拼接可导致该基因的删除,因而其拼接效率低于EIAVmRNA外显子-2、3之间的拼接效率。实验数据表明,EIAV SA2拼接信号序列单碱基变异提高了SD2-SA2拼接效率;D—AEIAV SA2-SD2拼接效率比DLA EIAV相应位点拼接效率高。     

免疫抑制对EIAV弱毒疫苗免疫马体内疫苗弱毒株载量的影响

为了研究马传染性贫血弱毒疫苗EIAVFDDV在体内的生物学特性,特别是在免疫马血浆中低拷贝存在状态的形成原因,使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫马匹进行了免疫功能抑制．连续给药10天后,以植物血凝素（PHA）作为刺激原的淋巴细胞非特异性增殖实验表明,实验马匹的免疫系统功能受到了明显抑制．使用实时RT-PCR对免疫抑制前后实验马匹体内EIAVFDDV的载量进行了定量检测．结果显示,EIAVFDDV免疫马匹体内的病毒载量在2匹马中未见升高,1匹马体内略有增高,但仍处于EIAVFDDV在免疫马匹体内载量的正常范围．作为对照,强毒株隐性携带马的病毒载量提高了约25000倍,并出现了典型的临床症状．实验结果提示,致弱后病毒特有的生物学特性,而非免疫压力,是EIAV疫苗株在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因．同时,在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在免疫马体内仍然表现出了相对稳定的低拷贝复制状态,进一步显示了EIAVFDDV在应用中的安全性．     

马传染性贫血病毒白细胞弱毒疫苗株及其亲本毒驴强毒株前病毒基因组比较分析

为阐明马传染性贫血白细胞弱毒疫苗株(EIAVDLV)的致弱和免疫保护机理,对EIAVDLV121及其亲本驴强毒株(EIAVDV117)前病毒全基因组序列进行了测定,并结合准种理论,分析了EIAV疫苗致弱过程中基因组进化特点。利用LA-PCR技术对EIAVDV117和EIAVDLV121的前病毒基因组分两段进行扩增,分别获得4个和10个前病毒全基因组序列。EIAVDV117前病毒基因组平均为8236bp,G C含量38.0。EIAVDLV121前病毒基因组平均8249bp,G C含量37.3。两者的前病毒基因组平均差异率为2.8。其中S2、LTR和env基因差异较大,分别为4.1、3.9和3.1。此外,S2、S3和env推导的氨基酸的差异明显,分别为10.4、5.6和4.8(gp90为6.8)。EIAVDLV121各基因的异质性均显著高于EIAVDV117。研究发现体外培养的EIAVDLV121至少有5种类型的LTR混合存在。在gp90推导的氨基酸序列上,EIAVDV117比EIAVDLV121平均多2个N-糖基化位点,总数为19,其中3个为EIAVDV117特有。EIAVDLV121有1个疫苗株特有N-糖基化位点。研究结果为进一步探讨马传染性贫血弱毒疫苗生物学特性提供信息。     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株及其亲本强毒株前病毒核苷酸序列比较分析

以马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)感染细胞总DNA及其亲本强毒L株感染马外周血液白细胞中DNA为模板, 应用PCR方法分段扩增出DLA-EIAV和L株前病毒, 并将各段扩增产物克隆后进行测序. 根据国外发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列, 推导出DLA-EIAV和L株全基因组核苷酸序列, 经比较分析, DLA-EIAV株前病毒基因组全长8266个碱基, EIAV L株前病毒基因组共有8235个碱基. DLA-EIAV株与其亲本L株和DA株核苷酸序列相比, 同源率分别为97.0%和 97.5%. DLA-EIAV株和L株相比, 长末端重复序列(LTR, 由U3, R, U5组成)、编码囊膜糖蛋白的基因env及ORF S2变异率很高, U3, R, U5, env及ORF S2核苷酸序列差异率分别达13.2%, 7.5%, 5.1%, 2.7%和3.9%, env基因及ORF S2推导的氨基酸序列差异率分别为4.4%和8.8%. 从EIAV高度变异的env各个毒株中鉴定出6个氨基酸序列保守区, 并发现中国的EIAV强、弱毒增强子区有转录因子GATA结合一致序列. 序列比较发现EIAV L比DLA株多2个N连接糖化位点. DLA-EIAV, L和DA株在ENH的主要差别是, DLA-EIAV株含有转录因子bHLH作用一致序列. 另外, DLA-EIAV株TAR茎的起始部位发生了改变, 形成一个尿嘧啶小泡. 这些变异对EIAV毒力的影响有待进一步研究.     

汉坦病毒HTN261株S基因片段的核苷酸序列测定及分析

黑龙江省是肾综合征出血热(HFRS)的重疫区。近年来HFRS年的发病人数曾超过万人。流行病学和血清学研究表明黑龙江省HFRS疫区主要是姬鼠型,但目前尚缺乏病毒的分子生物学资料。我们对从疫区捕获的宿主动物-黑线姬鼠肺中分离的汉坦病毒HTN261株的S基因片段的全基因序列进行了测定和初步分析。结果如下,HTN261株的S基因片段的全序列长为1697nt。只有一个主要的编码N蛋白的ORF,起始位置为第37nt,终止于1326nt,编码的蛋白长为429aa。没有发现存在ORF2。HTN261株的S基因片段核苷酸序列与HTN型中的病毒株的同源性很高,而与汉坦病毒其他型的同源性较差。从种系发生树分析来看,HTN261株归结于汉坦病毒的HTN型。在HTN型之内,HTN261株和HTN76-118株在一个分枝内。就其核苷酸和蛋白的同源性来说,HTN261株和HTN76-118株的同源性分别是89%(全S基因)和98%(蛋白)。而与中国境内发现的其他汉坦病毒株Z10,HU,Chen4,NC167等基因和蛋白的同源性相对较差。汉坦病毒除具有其宿主的依赖性外,还具有其地理的簇集性。HTN261株和HTN76-118株之间S基因和N蛋白序列的变异性的差异分别为11%和2%,表明HTN261株和HTN76-118株还有不同,可能是不同的亚型。不过,尚有待于进一步研究证明。