鹅细小病毒分离株HG5/82的分子特征分析

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段.将该片段分别进行克隆及序列测定,并与GPV国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较.结果表明HG5/82株非结构蛋白(Non-structure,NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸.HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸.序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征.为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础.结构基因VP3间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性.HG5/82与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性.     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析

利用PCR技术,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因.将该PCR扩增片段克隆入pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后,获得含1.6kb基因片段的重组质粒GpG3.序列测定结果表明,该片段与国外已报道的GPV B株苷酸序列有96%的同源性,氨基酸序列有97%的同源性.     

鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

根据鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖.筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用Nco Ⅰ酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp2 5'端969bp片段的原核表达载体.经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体.薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%.包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体.Western blot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性.     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸.该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段.     

鹅副粘病毒WF（01）G株F基因的测序与蛋白特性分析

用鹅副粘病毒WF01G分离株进行9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01G病毒的F基因,获得了1条长约1.7 kb的特异性条带。对PCR扩增产物测序。结果表明,扩增片段大小为1782 bp,含有1个1662 bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF01G株与其他7株鹅副粘病毒的同源性为84.8%-98.8%,与国内外其他NDV F基因的同源性为84.7%-93.8%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86.8%,说明WF01G与国内外的传统毒株有较大变异。与Tai-wan95株的同源性为93.8%,说明WF01G与Taiwan95株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-G ln-Lys-Arg-Phe117,表明为副粘病毒强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。     

鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp25’端969bp片段的原核表达载体。经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体。Westernblot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性。     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1．7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R—T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株BHD衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株BHDV序列相互间同源性高达98．2％一99．0％,其推导的氨基酸序列同源性也达98．3％--99．1％,为极度保守片段。     

鹅副粘病毒WF00 G分离株HN蛋白基因的测序与序列分析

用鹅副粘病毒凤阳分离株WF00G做9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF00G病毒的HN基因,获得了1条约1．8kb的特异性条带。PCR产物回收纯化后测序。测序结果表明,扩增片段大小为1844bp,含有1个1716bp的开放性阅渎框,编码571个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF00G株与其他12株鹅副牯病毒的同源性为89．9％-99．2％,与国内外其他NDVHN基因的同源性为81．7％～95．7％,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为84．7％,说明WF00G与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和NL／96株的同源性为94．3％和95．7％,说明WF00G与Taiwan95株和NL／96株亲缘关系较近,具有较高的相似性。     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒。雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%。电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子。免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirusDPV)标准株阳性血清有明显沉淀线。经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%。根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV。为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右。     

鸭细小病毒04Nb株的分离鉴定与rep基因测序与分析

采集浙江宁波地区以腹泻、呼吸困难为主要症状的病鸭肝组织,接种正常鸭胚尿囊腔增殖病毒.雏鸭感染试验显示发病症状及病理变化明显,死亡率为75%.电镜下可见纯化病毒直径约20nm左右的球形病毒粒子.免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duckparvovirus DPV)标准株阳性血清有明显沉淀线.经SDS-PAGE呈现3条结构蛋白带,与DPV标准株一致;参照GenBankDPV非结构蛋白基因序列设计引物,PCR扩增反应获得目的条带,克隆测序后,与DPV代表株序列同源性达98%.根据上述实验结果,确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV.为进一步研究该分离株rep基因的序列特征,对其rep基因克隆测序,与GenBank中两株DPV、两株鹅细小病毒(GPV)进行序列比对,结果显示rep基因核苷酸序列与DPV参考毒株同源性为98%以上,与GPV同源性为80%左右.     

蓝狐细小病毒的分离鉴定及其VP1 基因序列分析

从泰安地区送检的疑是细小病毒感染的蓝狐粪便中分离到一株病毒。经理化特性鉴定、血凝谱鉴定、人
工感染蓝狐等鉴定,表明所分离病毒为细小病毒。并且根据GenBank 上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,
CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,设计扩增VP1 基因的引物,采用PCR 技术扩增所分离
细小病毒的VP1 全基因,将PCR 产物克隆入pMD18 - T 载体,进行测序分析。结果,所分离细小病毒的VP1 基
因全长2 256 bp,编码727 个氨基酸,与CPV 和FPV 参照株的VP1 基因同源性在98. 7% ～ 99. 5% 。VP1 基因的
系统发生分析表明所分离病毒与FPV 的亲源关系最为密切。所分离病毒VP1 蛋白375 位氨基酸残基与CPV 的
VP1 蛋白氨基酸残基一致,但其223 位、236 位、246 位、466 位、707 位、711 位氨基酸残基与FPV VP1 蛋白的
氨基酸残基一致,该病毒VP1 蛋白序列表现出了过渡型序列特征,介于FPV 与CPV 间的过渡类型,这说明所分离病毒为蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BFPV),命名为BFPV - TA,蓝狐可能在CPV 的起源过程起到重要
的作用。     

大肠杆菌 LT B亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的增强作用

【目的】通过融合基因表达载体和共免疫基因表达载体研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚基基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的影响。【方法】提取大肠杆菌44815菌株基因组DNA,通过PCR方法从基因组DNA中扩增LTB基因,同时采用PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2的主要抗原表位基因(VP2-70,编码70个氨基酸)。将上述基因分别连接到含有人CD5信号肽序列的载体pcDNA-CD5sp上,分别构建成它们的分泌型真核表达载体,pcDNA-CD5sp-LTB和pcDNA-CD5sp-VP2-70。再利用酶切连接的方法构建LTB与VP2-70融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70。然后用pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-70组)、pcDNACD5sp-LTB-VP2-70(VP2-LTB融合组)、pcDNA-CD5sp-LTB/pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-LTB共免疫组)和pcDNA3.1A(空载体对照组)分别免疫小鼠。免疫后用间接ELISA检测不同时间小鼠血清的抗体水平,用MTT方法检测小鼠免疫5周后脾脏淋巴细胞的增殖活性。【结果】经过测序表明本研究扩增的LTB和VP2基因序列和构建的相关表达载体结构正确。通过Western-blot检测证明构建的表达载体均能介导相应基因在真核细胞进行分泌表达。ELISA检测结果表明,3组实验组小鼠接受VP2DNA疫苗免疫后均能产生特异的体液免疫应答反应,特别是VP2-LTB基因融合组小鼠的抗体水平在第5周时高达1:5120,明显高于其它两组(P<0.01)。3组免疫小鼠抗体的亚型均表现IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验结果表明,在ConA的刺激下,3组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),说明VP2DNA疫苗能够引起淋巴细胞的增殖。但3组免疫小鼠之间的刺激指数没有明显差异(P>0.05)。【结论】在小鼠体内,LTB基因表达载体可明显提高CPVVP2DNA疫苗的体液免疫应答水平。     

Isolation and Genomic Characterization of a Duck-Origin GPV-Related Parvovirus from Cherry Valley Ducklings in China

A newly emerged duck parvovirus, which causes beak atrophy and dwarfism syndrome (BADS) in Cherry Valley ducks, has appeared in Northern China since March 2015. To explore the genetic diversity among waterfowl parvovirus isolates, the complete genome of an identified isolate designated SDLC01 was sequenced and analyzed in the present study. Genomic sequence analysis showed that SDLC01 shared 90.8%–94.6% of nucleotide identity with goose parvovirus (GPV) isolates and 78.6%–81.6% of nucleotide identity with classical Muscovy duck parvovirus (MDPV) isolates. Phylogenetic analysis of 443 nucleotides (nt) of the fragment A showed that SDLC01 was highly similar to a mule duck isolate (strain D146/02) and close to European GPV isolates but separate from Asian GPV isolates. Analysis of the left inverted terminal repeat regions revealed that SDLC01 had two major segments deleted between positions 160–176 and 306–322 nt compared with field GPV and MDPV isolates. Phylogenetic analysis of Rep and VP1 encoded by two major open reading frames of parvoviruses revealed that SDLC01 was distinct from all GPV and MDPV isolates. The viral pathogenicity and genome characterization of SDLC01 suggest that the novel GPV (N-GPV) is the causative agent of BADS and belongs to a distinct GPV-related subgroup. Furthermore, N-GPV sequences were detected in diseased ducks by polymerase chain reaction and viral proliferation was demonstrated in duck embryos and duck embryo fibroblast cells.     

雏番鸭细小病毒vp3基因的原核表达及增殖病毒的检测

近年来,番鸭细小病毒出现新的流行趋势,估计与病毒基因变异有关,因此针对新流行毒株研发新的检测方法很有必要。本研究根据番鸭细小病毒(MDPV)2012年分离株SAAS-SHNH的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长vp3基因,经鉴定正确后,进行同源性比对分析,同时将其克隆到PET28a载体,构建成PET28a-VP3原核表达载体,经转化及IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,表达出与预期大小相符的63.1 k Da的蛋白,该蛋白可与临床采集的免疫过MDPV的番鸭血清结合,说明该蛋白可用于MDPV的血清学检测。将纯化后蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源MDPV-VP3蛋白的多克隆抗体,制备的兔源血清能够与MDPV疫苗弱毒株及J3D6株VP3蛋白发生特异结合;MDPV感染原代鸭胚成纤维细胞(DEF)后,利用兔源血清作为一抗进行免疫荧光分析(IFA)分析,在DEF细胞核和细胞质内均能检测到VP3蛋白,表明利用VP3蛋白制备的抗血清可以用于MDPV免疫荧光分析细胞增殖病毒的检测。这为今后MDPV的快速检测提供了技术基础。     

番鸭细小病毒强、弱毒株VP2基因的序列测定比较

According to the complete nucleotide sequence of Muscovy duck parvovirus registered in the gene bank, two modified primers (LHMP7/LHMP8) were designed and, for each of them, a restriction endonuclease recognition site, SacⅡ or KpnⅠ, was included respectively. The DNA encoding VP2 structural protein of the wild strain MDPV Q and the attenuated strain MDPV 26 which had been derived by continued passage of virulent wild type (MDPV Q) in Muscovy duck embryo were amplified by PCR and recombined into T vector and sequenced respectively. It shows that both DNA encoding VP 2 structural protein of MDPV Q and MDPV which has been registered in the gene bank had the high homology (97.9%). MDPV 26 and MDPV Q displayed 99.7% identity, and shared 98.3% homology with that of reported MDPV.     

猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株印2基因进行的克隆和序列测定表明：SD-68株VP2基因全长1740bD,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPVSD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99％以上,氨基酸的同源性在96％以上。进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系最近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异最小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LX4纤突蛋白基因分子特征

应用RT-PCR方法分别扩增了中国地方分离株IBV LX4 S1和S2基因并进行了基因的克隆和序列测定.结果发现,LX4 S基因由3495个核苷酸组成,编码一条1164个氨基酸残基组成的多肽.S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由539和625个氨基酸残基组成.LX4 S基因推导氨基酸切割识别位点序列为HRRRR,与A2、SD/97/02和Z株相同,而与其它国内外参考毒株不同.与国内外10株已报道的具有全S基因序列的IBV参考毒株比较,LX4与国内分离毒株SD/97/02的核苷酸和氨基酸同源性最高.与32株国内外参考毒株的S1基因进化树分析比较表明,LX4与A2、SD/97/02、Z、TJ/96/02、JX/99/01和SAIBWJ等7个国内分离株在同一亚群内.在该亚群内,LX4与A2和SD/97/02亲缘关系更近,且三者在高变区和抗原表位均具有高度的同源性,而与本亚群内其它参考毒株对应的高变区和抗原表位同源性差异较大.LX4与H120 S1基因编码氨基酸的同源性虽然高于其它国外参考毒株,但同源性仍然较低,为75%.与参考毒株比较,LX4 S2基因的点突变造成其推导的氨基酸序列有11个位点发生改变,这些突变可能影响S2与S1蛋白之间的相互作用,从而影响S蛋白与特异性抗体的结合.     

猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99．9％、99．9％、99．7％、98．1％,氨基酸的同源性分别为99．7％、99．5％、99．5％、96．7％。PPV SD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPVNSl的进化树分析表明：PPVSD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系最近,与BPV3 NS1的亲缘关系最远;在Thr435和Ser473位点PPV SD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPV SD-68株NS1潜在的磷酸化位点。     

Construction of protease-deficient Candida boidinii strains useful for recombinant protein production: cloning and disruption of proteinase A gene (PEP4) and proteinase B gene (PRBI)

The yeast Candida boidinii PEP4 and PRB1 genes, encoding proteinase A (PrA) and proteinase B (PrB), respectively, have been cloned and their primary structures were analyzed. The open reading frames of the PEP4 gene (1263 bp encoding a protein of 420 amino acids) and the PRBI gene (1683 bp encoding a protein of 560 amino acids) were found. The deduced amino acid sequences of PrA and PrB are very similar to Saccharomyces cerevisiae PrA and PrB (64% and 61% identities, respectively). Both PEP4 and PRBI genes were disrupted in the C. boidinii genome by one-step gene disruption. The resultant pep4delta and the pep4delta prb1delta strains lost protease activity when compared with the wild-type original strain. The constructed C. boidinii strains are expected to be useful hosts for heterologous protein production.