GABAA受体在酒精依赖中作用的研究进展

酒精依赖的产生机制是由特定的GABAA受体亚单位介导的,并且能够影响其它GABAA受体亚单位,使其对一定剂量的酒精敏感.此外酒精还可以通过细胞内信号转导途径影响GABA在大脑不同区域及核团单元的表达.焦虑、抗惊厥、镇静催眠、认知功能障碍等由酒精依赖产生的现象或者机制,均与GABA受体的介导有关.这些机制包括酒精对GABAA受体的直接或间接的作用,以及GABA的合成和释放.因此对GABAA受体功能的研究,将有助于人们关注酒精依赖现象及其治疗手段,为寻找酒精依赖治疗药物和治疗酒精中毒的机制的提供新线索.     

可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因对马铃薯的遗传转化

马铃薯是淀粉生产中重要的农作物之一,而可溶性淀粉合成酶SSⅢ是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分,通过基因工程的手段来研究SSⅢ基因在淀粉合成中的功能可以用于改良马铃薯淀粉的品质.本研究采用根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV 35S驱动的可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的RNA干扰表达载体导入马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得了65株卡那霉素抗性植株.对抗性植株PCR检测结果表明,SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中,RT-PCR检测表明SSⅢ基因在转录水平上受到了明显抑制.该研究为马铃薯淀粉品质的改良奠定了基础.     

基于转录组测序的Cd胁迫下芹菜细胞自噬相关基因的筛选

细胞自噬是植物逆境应答过程中最常见的保护机制之一。动物中,自噬相关基因抵御镉(Cd)毒害的功能研究较清楚,但植物却知之甚少。文中以芹菜品种‘皇后’为试材,采用外源Cd(终浓度为0、2、4、8mg/L)添加营养液水培处理,利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选细胞自噬相关差异基因并进行q RT-PCR验证。结果表明Cd胁迫对芹菜植株产生了明显的毒害作用,并与浓度间产生了量效关系。在筛选的8个差异表达的自噬相关基因中,ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1、AMPK-2基因随Cd浓度升高表达上调,ATG12、VPS30和VPS34则先上调后下降,说明自噬相关基因可能通过表达上调增加了自噬小体结构以抵御Cd毒性作用;而高浓度Cd(8mg/L)可能超出芹菜的耐受范围,导致多个自噬基因又出现表达下调趋势。以上结果有助于后期自噬相关基因的功能研究,为进一步探讨芹菜对Cd胁迫的耐性机制提供参考依据。     

精原干细胞介导的基因编辑动物模型研究进展

合适的动物模型对于人类疾病的研究和药物开发至关重要。精原干细胞是位于睾丸组织曲细精管基底膜上的一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞,可以定向分化产生精子。利用精原干细胞作为基因编辑的对象,生产基因编辑的精子进行受精有望成为建立基因编辑动物疾病模型的一条有效途径。该文就精原干细胞的生物学特征、体外培养以及精原干细胞介导的基因编辑动物模型的进展和优缺点进行了阐述。     

铁皮石斛花总RNA提取方法的比较研究

为筛选铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)花总RNA提取方法,对8种提取方法进行了比较研究,包括改良CTAB-LiCl法(M1)、改良CTAB-异丙醇法(M2)、改良SDS-LiCl法(M3)、改良SDS-异丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取试剂盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0试剂盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法(M7)和Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法(M8)。结果表明,以M4和M5提取的总RNA带型清晰,完整性好,A260 nm/A280 nm为1.8～2.0,A260 nm/A230 nm大于2.0,RNA产率分别为(159.45±1.45)和(170.84±3.53)μg/g。利用M4、M5提取霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和美花石斛花的总RNA,样品的完整性、浓度和纯度均符合质量要求。以M4、M5提取的铁皮石斛总RNA为模板,扩增Actin基因片段,扩增产物大小与预期一致且条带单一。这说明M4、M5方法操作简便,结果重复性好,能够较好地提取石斛属植物花的总RNA。     

猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

铜绿假单胞菌cntRLMN操纵子介导锌离子摄取的功能鉴定

【目的】本研究以铜绿假单胞菌PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1,菌种编号ATCC15692)为对象,研究cntRLMN在锌离子摄取中的功能。【方法】在ΔznuBC的基础上,以同源重组的方法构建了cntRLMN的各种突变菌株,通过质粒接合转移的方法构建其互补菌株及lacZ转录融合报告菌株,运用β-半乳糖苷酶酶活检测研究了Zur蛋白对cntRLMN的转录调控,凝胶阻滞实验(EMSA)检验Zur蛋白与cnt启动子及cnt启动子的突变片段的体外结合,并进一步通过生长曲线分析对cntRLMN中cntR、cntL、cntN等基因的锌离子摄取功能进行了分析和鉴定。最终,通过构建大蜡螟幼虫的侵染模型来研究cntRLMN对铜绿假单胞菌毒力发挥的影响。【结果】lacZ转录融合的酶活分析显示cntRLMN受Zur蛋白的负调控,其表达以Zur蛋白依赖的方式受锌离子饥饿的诱导;EMSA实验的结果显示cntRLMN的启动子可以与His-Zur结合形成DNA-蛋白质复合体,结合位点为GCGTTATAGTATATCAT;生长曲线和大蜡螟幼虫侵染实验的分析结果显示ZnuBC和CntRLMN的功能存在互补性,仅znuBC和cntRLMN双缺失突变时菌株在限锌培养条件下的生长和对大蜡螟幼虫的毒性才受到显著抑制,说明CntRLMN代表另一种独立的锌离子摄取系统。【结论】cntRLMN是受Zur直接负调控的另一种独立的铜绿假单胞菌锌离子摄取系统,对铜绿假单胞菌毒力的发挥起重要作用。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

限制性内切酶Mlu I蛋白及其硒代衍生物的制备

【背景】限制性内切酶Mlu I是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu I蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu I,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu I蛋白和硒代Mlu I蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu I并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu I蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu I蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu I蛋白及硒代Mlu I蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu I三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。     

不同来源植物乳杆菌基因组结构和功能差异的比较研究

[目的] 本试验研究不同来源植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）基因特点以及在不同环境下其基因多样性,探究2株L.plantarum A8和P9在肠道生境及植物表面适应性的异同,为优良菌株的开发提供理论基础。[方法] 本研究对从动物肠道和植物表面分离获得的L.plantarum A8和L.plantarum P9的基因组进行分析,利用第二代测序技术（NextGeneration Sequencing,NGS）,基于Illumina NovaSeq测序平台,同时利用第三代单分子测序技术,基于PacBio Sequel测序平台,对L.plantarum A8和L.plantarum P9进行测序。采用Carbohydrate-active enzymes（CAZy）、Koyto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）和Clusters of orthologous genes（COG）数据库对基因组进行功能注释;采用CGView软件绘制菌株的基因组环形图谱。应用比较基因组学与已经公开发表的其他L.plantarum基因组进行比较分析。[结果] 由研究可知L.plantarum A8和L.plantarum P9基因组大小存在差异,通过构建系统发育树发现2株菌与其他来源的L.plantarum分在同一分支,并且L.plantarum P9与母乳来源的L.plantarum WLPL04菌株距离最近,而L.plantarum A8与L.paraplantarum DSM10667距离最近。通过基因家族分析可知,2株菌共有基因为2643个,其中包括一些抗应激蛋白如热休克蛋白、冷休克蛋白。L.plantarum A8和P9独特基因分别为321和336个,L.plantarum A8中独特基因主要参与DNA复制、ABC转运系统（ABC transfer system）、PTS系统（phosphotransferase system）、磺酸盐转运系统、氨基酸生物合成等代谢通路;L.plantarum P9的独特基因以参与碳水化合物的运输和代谢基因居多,例如rpiA基因、lacZ基因、FruA基因等。[结论] 通过比较基因组学方法解析L.plantarum的基因组信息,发现动物肠道来源的L.plantarum具有较好的氨基酸转运能力,植物表面附着的L.plantarum菌株具有较好碳水化合物利用能力,从而为益生菌的开发与利用提供理论依据。