人钠/二羧酸协同转运蛋白1基因融合表达及其抗体制备

利用DNA重组技术 ,将编码人钠 羧酸协同转运蛋白 1(hNaDC1)抗原表位区 (W138 Q2 19)的cDNA克隆至融合表达载体pGEX 5X 1,构建重组质粒pGEX hNaDCL6 .在大肠杆菌BL2 1中 ,经IPTG诱导 ,获得谷胱甘肽巯基转移酶 (GST) hNaDC1重组融合蛋白的表达 .以谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,获得纯化的GST hNaDC1.以此为免疫原制备的抗hNaDC1抗体可特异性识别人类和大鼠肾组织以及小肠组织中天然的钠 二羧酸协同转运蛋白 1.利用该抗体 ,首次证实了hNaDC1基因编码产物分布于人肾组织近端肾小管刷状缘 ,与大鼠钠 二羧酸协同转运蛋白 1(SDCT1)分布一致 .     

血管内皮细胞生长因子及其受体在IgA肾病患者肾组织中表达的研究

目的　检测 2 4例不同病理改变的IgA肾病患者肾组织中血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体VEGF R2 (flk 1)和Ⅳ型胶原的表达 ,并将其表达水平与临床病理改变进行相关分析。方法　应用免疫组织化学SP法。结果　VEGF主要表达于肾小球脏层上皮细胞 ,flk 1主要表达于肾小球和间质血管内皮细胞。肾小球内VEGF和flk 1表达呈正相关 (P <0 0 5 ) ,两者在中度病变组肾小球内表达最多 ,重度病变组表达最少 (P <0 0 5 )。随病理改变程度加重 ,患者 2 4h尿蛋白定量、血压、血肌酐水平均明显增高 (P <0 0 5 )。肾小球内VEGF表达在轻、中度病变组与尿蛋白水平呈正相关 (P <0 0 5 ) ;在重度病变组则无相关性 ,与患者血压、血肌酐水平也无明显相关性 (P >0 0 5 )。肾小球内Ⅳ型胶原随病变加重表达增多 ,在重度病变组表达最多 (P <0 0 1) ;在轻、中度病变组肾小球内VEGF表达与Ⅳ型胶原的表达呈正相关 (P <0 0 5 )。各组肾小球内VEGF表达与肾小球微血管密度呈正相关 (P <0 0 1) ,重度病变组肾小球微血管密度减少 (P <0 0 5 )。结论　这些结果说明VEGF在IgA肾病的病理进展过程中发挥重要作用 ,可能涉及内皮细胞通透性增强、细胞外基质合成增多、血管生成障碍等多种机制     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

人胚肺成纤维细胞WI-38中AngⅡ信号转导途径的研究

本文采用免疫荧光染色、凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot等方法,观察AngⅡ刺激人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞前后,细胞中信号转导子和转录激活子STAT3、STAT1的活化状态,进而了解AngⅡ的信号转导通路.结果显示AngⅡ通过其AT1受体诱导WI-38细胞中STAT3、STAT1的磷酸化,形成以磷酸化的STAT3同源二聚体SIF-A为主的复合物,并转位入核与DNA结合,参与调控基因的表达;AngⅡ的作用存在量效及时效效应,10-3mmol/L的AngⅡ刺激60min能最强诱导WI-38细胞STAT3、STAT1的活化.因此JAK/STAT途径参与介导了An-gⅡ在WI-38中的信号转导.     

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

鄱阳湖沉水植物区不同深度土壤甲烷排放对温度水分变化的响应

采集鄱阳湖沉水植物区0-10 cm和10-30 cm土壤样品,通过设置2个温度（18℃和28℃）和2个水分（淹水2 cm和土柱取出水面后的实际土壤水分含量）处理组合,进行持续2年的甲烷（CH₄）排放室内培养实验,以探讨不同深度土壤CH₄排放对温度、水分变化的响应差异,以及温度、水分和土层对湿地土壤CH₄排放的交互影响。结果表明：0-10 cm和10-30 cm土壤CH₄排放速率变化范围分别为0.01-3.63 μgCH₄-C kg^-1d^-1、0.02-1.99 μgCH₄-C kg^-1d^-1;均值分别为0.72和0.15 μgCH₄-C kg^-1d^-1。温度、水分和土层3因素及其交互作用均对土壤CH₄排放有显著影响（P<0.01）,且土层的影响最大。两水分处理下的CH₄排放对温度变化的敏感性均表现为0-10 cm（Q₁₀为1.78、3.26）高于10-30 cm土层（Q₁₀为1.04、1.08）。CH₄平均排放速率及累计排放量均表现为0-10 cm显著高于10-30 cm土层,且培养前期高于培养后期,显示基质有效性对土壤CH₄排放的重要影响。     

三种基因转导方法在不同代龄复制性衰老细胞中的比较研究

以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)为报告基因 ,检测腺病毒、逆转录病毒和脂质体对 2 0代和 33代WI 38细胞的转导效率、EGFP的表达强度、对细胞增殖能力和生物学行为影响 ,比较病毒及非病毒方法对不同代龄成纤维细胞 (WI 38)细胞基因转导的特性 .结果显示 :对 2 0代和 33代WI 38细胞,腺病毒转染效率均最高 ,逆转录病毒其次 ;EGFP表达强度腺病毒最高 ,逆转录病毒最低 ;各方法2 0代细胞转导效率及表达强度均高于 33代细胞 (P <0 0 5 ) .逆转录病毒对细胞繁殖和SA β gal染色没有影响 ,腺病毒和脂质体均能导致细胞增殖能力下降 ,SA β gal染色阳性率上升 ,尤以脂质体明显 (P <0 0 5 ) .表明逆转录病毒介导基因对WI 38细胞衰老进程几乎没有影响 ,且转导效率较高 ,适于衰老细胞转基因研究     

大鼠局灶性脑缺血后KCl诱导皮层扩散性抑制的体光学成像

采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型,在额叶皮层用KCl诱导产生皮层扩散性抑制(corticalspreadingdepression,CSD)。MCAO4h后,利用550nm内源信号光学成像(opticalintrin-sicsignalimaging,OISI)监测局灶性脑缺血后大鼠顶-枕叶皮层内源光信号变化。成像1h内观测到一系列诱导CSD波(14±3次),CSD波局限于顶-枕叶皮层中央区域扩展,以光强的显著下降为特征;而旁侧区域光强无明显改变,不具备CSD波特征,表明CSD波未传播到该区域。随后TTC染色证明上述旁侧区域已经梗死。实验表明:MCAO后4h,皮层区域旁侧部分会梗死;CSD波的OIS变化可用来区分缺血梗死区和外周供血较为完整区域(未梗死区)。     

激光微切割与定量PCR技术分析肾脏病理切片RNA

采用激光微切割与定量PCR技术,分析使用不同提取方法从不同固定方法固定的病理切片中提取的RNA.用70%乙醇、丙酮、甲醇、4%多聚甲醛固定肾脏冰冻切片,使用激光微切割技术切取肾小球,用硫氰酸胍方法(guanidinethiocyanatemethods,GTC)和Trizol试剂方法提取RNA,使用Taqman定量PCR方法分析比较各组RNA的量;选取丙酮固定的石蜡切片,使用激光微切割技术切取肾小球,采用RNA裂解液提取RNA,使用Taqman定量PCR方法,比较石蜡切片和冰冻切片中RNA含量.结果显示:提取沉淀性固定剂如乙醇、丙酮、甲醇固定的冰冻切片的RNA时,2种提取方法和3种固定方法对RNA含量的影响都无明显差异;但在提取4%多聚甲醛固定冰冻切片时,使用Trizol提取RNA含量明显高于使用GTC方法,且其含量与沉淀性固定剂固定的切片RNA含量无明显差异.石蜡切片中经激光微切割肾小球的RNA含量与冰冻切片经激光微切割肾小球的RNA含量无明显差异.结果提示:切片的固定方法和RNA的提取方法是影响切片RNA提取量的主要原因.     

从石蜡包埋的微量肾活检组织中提取及分析RNA

本文用氧钒核糖核苷复合物ＶＲＣ（ＶａｎａｄｙｌＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅＣｏｍｐｌｅｘ）孵育的方法,从石蜡包埋半年以上的肾组织中提取出ＲＮＡ,分析了ＲＮＡ的质量,探讨了影响ＲＮＡ提取的因素。在此基础上,我们又采用ｔＲＮＡ助沉的方法,进一步从石蜡包埋的微量肾活检组织中提取出ＲＮＡ,并用逆转录热启动ＰＣＲ（ＲＴ－ｈｏｔｓｔａｒｔ－ＰＣＲ）方法,观察了石蜡包埋的肾活检组织中细胞因子的基因表达。