应用大规模测序技术和生物信息学研究造血干/祖细胞的基因表达及新基因 的识别和克隆

从新生儿脐血和成人骨髓中分选出造血干/祖细胞(HSC/HPC),构建成cDNA文库,对其进行大规模表达序列标签(EST)测序,通过生物信息学等手段分析基因表达谱,并进行新基因的全长cDNA克隆。在所测的10512条可分析E ST序列中,有9866条来自脐血CD34+|细胞,其中4697条(47.6%)为已知基因,2603条(26.4%)为已知EST,1415条(14.3%)代表未知EST。在已知基因中,8.2%基因与造血相关,22.7%涉及细胞代谢、结构和迁移,13.0%与细胞分裂和防御相关,26.2%与RNA、蛋白质的合成相关,10.6%和细胞信号传递有关。对一些已知和未知的EST,综合测序、生物信息学等方法,进行全长克隆,已获得23个新基因的全长cDNA。 Abstract:Hematopoietic stem/progenitor cells were isolated from umbilical cord blood and adult bone marrow,and subject to cDNA library construction.The gene expression pattern in CD34+ cells and the identification and cloning of novel genes were performed by sequencing ESTs and analyzing them with the tools of bioinformatics.Among the obtained 10 512 ESTs which could be further analyzed,9,866 were from umbilical cord blood where 4 697(67.6%)were known genes,2 603(26.4%)were known ESTs and 1415(14.3%)represented novel ESTs.Within the identified genes,8.2% was involved in hematopoiesis,22.7% was associated with cell metabolism,structure and mobility,13.0% was linked to cell division and defence,26.2% was related to RNA protein synthesis and 10.6% was related with cell signal transduction.In parallel,we developed an efficient working system combining sequencing,bioinformatics,etc.and obtained 23 full-length cDNAs from both known and novel ESTs identified in this work.     

一种利用λRed重组技术在杀鱼爱德华氏菌基因组添加标签的方法

在杀鱼爱德华氏菌病原学研究中,在动物中制备杀鱼爱德华氏菌蛋白抗体耗时长,且获得的多克隆或多肽抗体在宿主细胞中特异性差,背景信号强。为解决这一问题,对在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中建立起来的λRed基因编辑方法进行调整和优化,建立了在杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)基因组基因上添加HA标签序列的方法,为使用标签抗体研究杀鱼爱德华氏菌基因功能提供便利。λRed重组系统利用同源线性DNA片段与基因组DNA进行重组。即以质粒pSU315为模板,在引物上引入目的基因的特异性序列,扩增FRT序列和抗生素抗性基因;以获得的PCR产物转化携带pKD46的杀鱼爱德华氏菌,在pKD46表达的λ噬菌体的3个重组蛋白(Exo、Beta和Gam)作用下, PCR产物与杀鱼爱德华氏菌基因组发生同源重组,获得引入了抗生素抗性的靶基因缺失或靶基因携带标签序列的菌株;接着利用pKD46的温敏型特性,消除引入的pKD46;最后向杀鱼爱德华氏菌引入文章构建的表达Flp重组酶的质粒pKD46-flp,在FLP作用下,两个FRT位点之间发生重组,...     

植物抗病基因克隆研究进展

随着分子生物学及其相关技术的飞速发展,人们对植物与病原微生物相互作用的分子机制了解得越来越透彻。本文对植物过敏性反应和系统获得抗性作了简要概述,并着重讨论了植物抗病基因克隆的进展,涉及到转座子标签技术、定位克隆技术、染色体步行、染色体登陆等方法和策略,归纳了克隆到的植物抗病基因及其产物结构,概述了这些基因产物所共有的特点,并简要介绍了植物抗病基因工程的进展。     

酿酒酵母转座标签插入突变体263-H9中高盐胁迫基因的确定

突变体263-H9是利用mTn3转座标签对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W303-1A诱变、筛选得到的。该突变体表现出对多种逆境胁迫(1.5 mol/L山梨醇高渗透压胁迫、0.65 mol/L NaCl高盐胁迫和15℃低温胁迫)敏感的表型特征, 而且与其他突变体不同其转座标签的插入位点是GIP2和YER053C-A的基因间隔区域。本文通过基因敲除、基因组文库功能互补等多种分子生物学和遗传学方法, 确定了突变体263-H9的敏感表型不是由于转座标签的插入直接引起的, 而是盐胁迫反应信号传导途经中重要的基因PBS2发生部分缺失, 造成该基因不能正常表达, 而导致的表型变化。     

干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下的刚毛柽柳根部组织cDNA为tester,正常生长的刚毛柽柳根部组织cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了干旱胁迫下刚毛柽柳根部组织的消减文库。文库克隆的重组率为95%,插入片段大部分集中在250~600 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如Mn-SOD、myb相关蛋白、锌指蛋白等17种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。所得EST序列已被GenBank收录。实验为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下柽柳根部基因的表达奠定了基础。     

EST-SSR标记在水曲柳雌雄鉴定中的应用

选用黑龙江省青山林木种子园成年水曲柳200棵树为实验材料,在来自NCBI中的5 423条白蜡属EST序列和该实验室测得的水曲柳转录组的179 502条序列中查找SSR位点并设计引物,通过PCR扩增筛选有效扩增和有差异片段的引物,用于水曲柳雌雄的鉴别。结果显示:(1)白蜡属EST和水曲柳转录组中的5 423条和179 502条序列中,分别查找到9 488个和3 557个SSR位点,SSR出现的频率分别是174.96%和1.98%,SSR的类型都是以二核苷酸为主。(2)232对引物中有208对引物获得有效扩增,74对引物在雌雄DNA中有差异,27对扩增片段符合预定大小片段。(3)经过3轮筛选,选出19号和56号引物用于200棵水曲柳中,雌雄差异率分别是64.5%和89.5%。研究表明,利用EST-SSR分子标记对水曲柳性别进行鉴定是一种有效可行的方法。     

不同标签辅助的IBTX原核表达纯化及活性鉴定

目的:在原核体系中建立高效表达纯化IBTX(Iberiotoxin)的工艺,并比较不同标签对IBTX生物活性的影响。方法:利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得IBTX编码基因,以此为模板分别构建了表达质粒PET32a(+)-IBTX、pGex-6p-1-IBTX、pDuet-MBP-IBTX,并将其转入E.coli(BL21)分别表达带有硫氧还原蛋白(TRX)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的IBTX融合蛋白,在经过亲和层析、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切、C18反向层析纯化后真空冻干得到IBTX干粉,以电生理实验检测其生物活性。结果:在三种标签帮助下通过原核体系表达出的IBTX都能够特异性的阻断大电导Ca2+激活的钾通道(BK)电流,其中MBP帮助折叠的m-IBTX活性最佳。结论:建立了IBTX在MBP标签帮助下的原核表达纯化工艺,为进一步研究蝎钾离子通道α家族神经毒素及其突变体的原核表达奠定了基础。     

食育干预对初中学生健康素养的影响

目的：通过对北京市房山区良乡六中学生进行食育干预,评价食育干预对改善饮食相关健康素养的效果。方法：选择自愿参与“食育社团”的初一、初二学生33人作为干预班开展为期6个月的食育干预（包括13个课程模块及7个健康促进活动模块）,未参与“食育社团”的同班其余同学作为对照班,于干预前后分别进行“饮食相关健康素养”调查。结果：干预班学生对现代营养和中医饮食营养知识的知晓率较干预前明显提高,“总是”能够根据季节调节饮食的学生比例显著提升至45.5%;干预班学生在营养标签查阅率、认知率和行为规范率三方面变化显著,认为营养标签对选择食物“很有帮助”且会运用营养标签帮助选择食物的人数比例分别提升42.4%和36.3%（P＜0.05）。干预班学生对大豆、粗粮和薯类、水产品的选择,运动频率及睡眠时间较对照班明显改善,但仍存在禽畜肉、蛋类摄入频率不足,肥肉、快餐、饮料、零食摄入频率较高,久坐人数较多的问题。结论：食育干预对改善中学生饮食相关健康素养有积极促进作用。     

促进原核表达蛋白可溶性的研究进展

以大肠杆菌为代表的原核表达蛋白系统具有操作简单、周期短、成本低、表达量高等优点而成为获得外源表达蛋白的首选方案。但外源蛋白在原核宿主中往往以无生物活性的包涵体形式存在,这限制了原核表达系统的广泛应用。随着对蛋白折叠动力学、参与蛋白折叠的酶和分子伴侣等认识的不断深入,科学家们通过诱导条件优化、宿主细胞改造以及使用融合标签等手段,在促进原核表达蛋白可溶性方面取得了较大的进展。就这些研究进展进行综述,旨在为设计和获得原核可溶表达蛋白的实验方案提供参考。     

石刁柏EST序列中微卫星分布特征分析

目的:开发新型石刁柏EST - SSR分子标记和开展相关的分子生物学研究.方法:利用EST - trimmer、Repeat Masker、SSRIT等生物信息学分析工具对石刁柏EST数据库中的EST序列进行去除poly A/T尾,载体、重复序列和低质量序列处理,并对EST序列中SSR分布特征进行了分析.结果:在NCBI数据库中下载的8 565条石刁柏EST序列中,重复次数超过5次的SSR共有610个,其中分布于601～ 800bp的EST - SSR标记最多,共464个,占SSR总数的77.33％;主要SSR重复基元类型是二核苷酸,共426个,占SSR总数的69.84％,其次是三核苷酸占SSR总数的29.18％.四核苷酸和五核苷酸的SSR仅各3个.结论:石刁柏EST中存在丰富的SSR信息,其中二核苷酸的AG/TC、GA/CT以及三核苷酸的CTT/GAA是SSR主要的重复单元.