线粒体基因组数据的分析方法和软件

线粒体基因组的研究已经普及,其正确的拼接和注释是所有后续研究的基础。本文以Staden Package软件为主介绍了拼接和注释的线粒体基因组的方法,同时介绍了其他常用的拼接软件ContigExpress、DNAMAN、DNASTAR、BioEdit和Sequencher,以及利用不同软件(包括DOGMA、MOSAS、MITOS、GOBASE、OGRe、MitoZoa、tRNAscan-SE、ARWEN、BLAST和MiTFi等)对线粒体基因组中的蛋白质编码基因、rRNA、tRNA和A+T富集区进行注释的方法,最后介绍了利用MEGA5软件分析线粒体基因组的组成、Sequin软件提交序列和线粒体基因组数据绘图工具(CG view、MTviz和OGDRAW)。     

《细胞》：艾滋”马赛克疫苗”拼接多种基因

美国研究人员10月24日说,他们开发出一种拼接多种基因的”马赛克疫苗”。动物试验显示,该疫苗可使艾滋病病毒感染风险降低约90％。这一研究成果有可能为人类”防艾”带来新希望。     

平末端DNA随机连接构建重组质粒

目的:拼接DNA片段并克隆。方法:用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果:通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论:该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。     

通过染色体步查建立水稻G200座位的重叠群

分别以G200及其旁侧区的Y2587L、Y4073L和L688片段为探针筛选水稻基因组YAC文库,共得到4个阳性克隆,均与G200、Y2587L和Y4073L座位重叠,插入片段的大小为240～650kb。用反向PCR法分离YAC克隆插入片段的末端序列,并利用这些末端序列确定克隆的方向以及进行染色体步查,共筛选到7个YAC克隆,建立了一个8厘摩(cM)的G200 YAC重叠群。     

人Xp21．1－p21．3上3．5MbYAC重叠群构建及物理图谱分析

用Ａｌｕ－ＰＣＲ指纹图谱法分析了人Ｘｐ２１．１－ｐ２１．３上一系列的酵母人工染色体（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ,ＹＡＣ）克隆,发现其中的两个ＹＡＣ克隆构成包含ＤＸＳ１６６位点的重叠群,而且这一重叠群与以前构建的包含ＤＭＤ基因全序列的ＹＡＣ重叠群相连接,ＹＡＣ克隆末端探针交叉杂交证实了这一重叠,使这一ＹＡＣ重叠群至少延伸至ＤＸＳ１６６位点,形成一个跨度为３．５Ｍｂ的ＹＡＣ重叠群。基于这些重叠的ＹＡＣ克隆绘制了这一区域的大尺度限制酶切图谱,并在这一图谱上定位了ＤＸＳ１６６位点,从而确定了ＤＸＳ１６６位点与ＤＭＤ基因的物理关系。这一工作为ＤＭＤ基因的５＇远端调控作用研究及该区域未知基因的克隆奠定了基础。     

蚊虫地理生态位及其重叠群划分的初步研究

本文将物种在地理上的分布范围作为地理生态位（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｎｉｃｈｅ）提出,并对我国蚊虫的地理生态位进行了研究。内容包括：蚊虫地理生态位宽度、地理生态位重叠指数的测定和９种蚊虫重叠群的划分。     

PCR筛选BAC文库和直接BAC末端测序方法的建立

建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦BAC DNA 文库和直接对 BAC DNA进行末端测序的方法.用PCR技术进行大麦BAC DNA 文库(含816个平板,每个平板含384个克隆)的筛选分4步进行.在实验中,建立了两个水平的BAC DNA池(一级池和二级池).一个二级池由一个平板(含有384个克隆)的DNA 组成,一个一级池由连续10个稀释100倍的二级池的DNA混合而成(如1～10,11～20等),共82个一级池.BAC DNA 文库筛选的第一步是对82个一级池的筛选.得到阳性一级池后(如2号一级池),对其所含的10个二级池(从11～20)进行第二步筛选.得到阳性二级池后,培养相应的阳性平板的所有克隆(384个),从头开始(左上侧),每相邻的4个克隆为一组,在96孔板上(4 X 96=384) 进行第三轮PCR反应;之后对筛选结果为阳性的4个克隆分别进行菌落 PCR(第四轮)得到单一阳性克隆.根据BAC DNA Hind III 酶切指纹图谱,对同一引物筛选的BACs进行重叠群作图(Contig).对代表contig 的两端的BAC DNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列.根据测序和Blast结果设计引物,用中国春附加系(附加大麦染色体)对来自BAC克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图,以确定是否可以用作下一步的染色体步行.     

一种使用混合PCR筛选技术高效延伸水稻BAC—重叠群的方法

使用“克隆连克隆 (clonebyclone)”战略进行水稻基因组测序需要依赖于构建好的基因组物理图。工作着眼于水稻籼稻广陆矮 4号 (OryzasativaindicaGuangLuAi4)第四号染色体长臂上 5 6 .1～ 6 8cM的区域 ,采用PCR方法筛选BAC全库来延伸重叠群 ,构建物理图。通过参照特异遗传探针定位的BAC克隆 (seedBAC)末端序列设计了 14对引物 ,按特定规则分成 3组 ,分别以代表水稻BAC库 (共 2 2 36 8个BAC )的 2 33个BACpool为模板进行PCR反应 ,一共获得了 6 5个阳性BAC克隆 ,通过末端测序、酶切杂交等方法确定了其中 2 9个BAC克隆作为有效延伸的克隆 ,延伸了 8个重叠群。通过酶切杂交、末端测序等方法还获知阳性BAC的延伸方向、延伸长度以及与seedBAC之间的重叠长度。8个重叠群总的延伸长度达到5 10kb。与实验室原用于作物理图的其他方法如指纹图、点杂交等相比 ,该方法有高效率、高灵敏度、专一性好、可重复使用等优点。创新之处在于通过引物的合理分组和PCR实验条件的改进降低了假阳性和假阴性率     

小鼠一个新基因mLPTS的克隆、表达及亚细胞定位

利用EST拼接技术,RT－PCR及DNA序列测定,首次成功克隆了小鼠新基因mLPTS。获得的mLPTS基因片段长1244bp,编剧了一个由332个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质与人的LPTS蛋白有78％的同源性,LPTS基因是本实验室通过定位候选克隆策略获得的一个新的肝癌相关基因。它在肝癌组织中不表达或低表达,并参与细胞生长的负调控。小鼠mLPTS基因在小鼠的各个组织中都有表达,与人LPTS基因的表达组织分布相同。分析比较了LPTS蛋白在不同物种间的序列同源性,发现LPTS在进化上是高度保守的,是一个具有重要功能的基因。将mLPTS基因与绿色荧光蛋白EGFP融合构建真核表达载体,在中国仓鼠卵CHO细胞中表达,发现mLPTS基因表达产物位于细胞核仁中,为进一步研究该基因的功能及作用途径提供了重要信息。     

hCG嵌合肽（CP18—21）的构建和原核系统表达

目的：简化该测定－用含hCG亚单位的3个B细胞表位嵌合肽（CP）检测免疫动物血清中是否产生抗hCGβ环肽^38-57和其羧基端37肽抗体,方法：已知CP1及其衍生物中选用的破伤风类毒素的一个广谱性TCE^580-599(T6)中也还包含一个BCE,特异构建了含单（β5）或双（β9和β8）表位的二组CPs,首先以CPS（T1－T2－5－T6－β5－β9－β8）和CP7（T1－T2－5－T7－β5β9－β8）cDNAs为模板,用PCR方法产生删除β9和β8表位编码顺序的CP4和CP8 cDNAs,并按全拼接合成法产生删除β5表位顺序的CP5和CP9 cDNAs。但是,诱导的宿主菌总蛋白在SDS－PAGE带谱中未特异表达,于是也按前述方法,在以上检测用CPs基因5'端分别接上一段pZP4肽编码序列。结果：重组插入温度诱导型pBV221表达载体后,CP18－21cDNAs均在宿主菌中表达,而且在蛋白印迹试验中,CP18和CP20表达蛋白能识别Ohio州立大学Vernon Stevens教授惠赠的兔抗hCGβ环肽（含β5表位）多抗,而CP19和CP21（含β9和β8表位）表达带可与Dr.Wim Stevens赠送的单抗OT3A发生抗原抗体反应。意义：CP18－21及其表达工程菌的成功构建,为今后分析基因工程表达的CP1和CP7等hCG CPs系列的免疫原性奠定了基础。