The Mesenchymal Stem Cells Derived from Transgenic Mice Carrying Human Coagulation Factor VIII Can Correct Phenotype in Hemophilia A Mice

Hemophilia A （HA） is an inherited X-linked recessive bleeding disorder caused by coagulant factor VIII （FVIII） deficiency. Previous studies showed that introduction of mesenchymal stem cells （MSCs） modified by FVIll-expressing retrovims may result in phenotypic correction of HA animals. This study aimed at the investigation of an alternative gene therapy strategy that may lead to sustained FVIII transgene expression in HA mice. B-domain-de/eted human FVIll （hFVHIBD） vector was microinjected into single-cell embryos of wild-type mice to generate a transgenic mouse line, from which hFVIIIBD-MSCs were isolated, followed by transplantation into HA mice. RT-PCR and real-time PCR analysis demonstrated the expression of hFVlllBD in multi-organs of recipient HA mice. Immunohistochemistry showed the presence of hFVIIIBD positive staining in multi-organs of recipient HA mice. ELISA indicated that plasma hFVIIIBD level in recipient mice reached its peak （77 ng/ mL） at the 3rd week after implantation, and achieved sustained expression during the 5-week observation period. Plasma FVIII activities of recipient HA mice increased from 0% to 32% after hFVIIIBD-MSCs transplantation. APTT （activated partial thromboplastin time） value decreased in hFVIIIBD-MSCs transplanted HA mice compared with untreated HA mice （45.5 s vs. 91.3 s）. Our study demonstrated an effective phenotypic correction in HA mice using genetically modified MSCs from hFVIIIBD transgenic mice.     

转基因动物育种产业化现状和发展趋势

与传统的育种方法相比,转基因动物育种具有诸多优点,利用该技术得到的转基因鼠、转基因羊、转基因牛等动物,已经显示出巨大的商业前景。本文从动物转基因技术入手,结合相关专利,分析了近几年转基因动物育种技术的发展和趋势。重点从转基因动物育种在医药和农业上的应用,分析国内外目前的产业化状况。最后根据产业化中的一些问题及国内外差异,对我国转基因动物育种产业化提出建议,并进行了展望。     

主要转基因作物研究现状及其商业化发展态势

转基因作物是全球农业生物技术领域的研究热点,特性以抗除草剂性能和抗虫性能为主。目前全球已有29个大规模商业种植转基因作物的国家和地区,品种主要有玉米、大豆、棉花和油菜。但是,转基因作物在食品安全、生态安全、增产效果等方面尚存在许多争议,阻碍了转基因作物的大规模推广。本文就转基因作物研究现状及其商业化发展情况进行重点分析。     

植物转基因技术——回顾与前瞻

自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构以来, 以DNA重组技术为基础的转基因技术迅速发展, 不可避免地对人们的日常生活产生了巨大的影响。该文回顾了植物转基因技术的发展历程和现状, 重点介绍了基因定点突变技术ZFN和TALEN, 以期帮助读者全面快速地了解这一令人充满期待的新的转基因技术。     

利用实时荧光定量比较Ct法检测转基因小鼠外源基因拷贝数

目的：在建立转基因小鼠模型时,外源基因拷贝数是影响其表达水平和遗传稳定性的重要因素之一。外源基因拷贝数的精确测定,是建立转基因动物模型的重要环节。方法：合成cagA基因和内参基因GAPDH的引物,用标准曲线法测得cagA和GAPDH基因的扩增效率分别为97．6％和98．6％;将128拷贝阴性小鼠基因组和128拷贝c0鲥打靶质粒的混合物作为参照样品,取6只来自同一母本的F2阳性小鼠的128拷贝基因组作为待测样品;选取GAPDH作为内源参照基因,用比较Ct法对待测样品进行定量。结果：经计算,6只待测小鼠的cagA基因拷贝数平均值为8。结论：利用实时荧光定量PCR仪,呆用改良后的比较Ct法对转基因小鼠的外源基因拷贝数进行了精确测定。     

c—Ha-ras在转基因小鼠模型C57-ras各组织中的表达谱分析

目的：分析转基因c-Ha-ras在C57-ras癌症小鼠模型中的组织表达谱及时空表达差异。方法：利用半定量及荧光定量RT-PCR法,分析不同首建鼠系、不同周龄小鼠各脏器中转基因c-Ha-ras的表达。结果：转基因c-Ha-ras在心、肝等13种组织器官中均有表达,在肺脏中表达最高,在肝脏中表达最低,No.2、No.3和No.5等3个首建鼠均呈现相似的变化规律;转基因在No.5首建鼠中表达水平最高,而在同一个首建鼠系中,12周龄时表达高于8周龄和24周龄。结论：转基因c-Ha-ras在各脏器中能高效表达,并间接表明该转基因能稳定遗传,为C57-ras癌症小鼠模型用于新药临床前致癌性评价提了供理论支持。     

转基因杨树林下种植转基因棉花对转基因杨棉复合系统内节肢动物群落多样性的影响

【目的】转Bt基因棉花和转Bt基因杨树在我国已推广使用。本研究的目的是调查和分析不同转基因杨棉复合系统内地上节肢动物群落多样性变化,为转基因杨树大规模应用提供生态安全方面的数据。【方法】2019年4-10月,在河北任丘采取欧洲黑杨Populus nigra林下种植转基因棉花Gossypium hirsutum的模式,设置转基因杨树 转基因棉花(复合生态系统1)和非转基因杨树-转基因棉花(复合生态系统2)两种杨棉复合系统,调查杨树和棉花地上部植株节肢动物种类和个体数量,比较节肢动物各功能群的物种数量和个体数量以及香农指数、优势集中性指数、均匀度指数等群落多样性指数,并测定了转基因杨树和棉花叶片Bt蛋白含量。【结果】复合生态系统1中转基因杨树和棉花各自植株上鳞翅目种群累计个体数均显著低于复合生态系统2相应植株上的个体数量。转基因杨树上叶甲类累计个体数量显著高于非转基因杨树上的,寄生蜂类累计个体数量则显著低于非转基因杨树上的。在6月5日、6月21日和9月7日的调查中,转基因杨树上的节肢动物群落香农指数显著高于非转基因杨树上的。除鳞翅目害虫外,2个复合系统中棉株上节肢动物各功能群累计个体数量无显著性差异,香农指数、优势集中性指数和均匀度指数随时间变化的趋势基本一致且同一调查时间无显著性差异,仅在8月17调查中复合生态系统1中棉株上节肢动物香农指数显著高于复合生态系统2棉株上的。将杨树和棉花上节肢动物各类群累计数量相加作为系统整体,复合生态系统1和复合生态系统2在香农指数、优势集中性指数和均匀度指数数值上无显著差异。在调查后期,2个复合系统中节肢动物种群均向杨树叶片聚集。转基因棉花叶片Bt蛋白含量在各调查期均显著高于转基因杨树叶片的。【结论】转基因杨树对靶标害虫种群数量有较好的控制作用,对同系统内棉花上鳞翅目害虫数量亦有协同控制作用。转基因杨棉复合系统中地上节肢动物群落结构稳定,对系统内棉花地上部节肢动物群落多样性无显著影响。靶标害虫对转Bt基因杨树的抗性发展需持续监测。     

电穿孔法可用于家蚕基因功能分析(英文)

【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1 (Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control, NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。     

一株西瓜枯萎病生防菌的鉴定与田间防效

【背景】西瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)引起的土传病害,是西瓜最为严重的病害之一。利用拮抗微生物抑制病原菌繁殖,降低其危害程度,已成为西瓜枯萎病防控领域的研究热点。【目的】筛选对西瓜枯萎病病原菌具有拮抗作用的菌株,并探究其抑菌作用,为有效防控西瓜枯萎病提供生防资源。【方法】从西瓜的根围土中分离细菌,采取平板对峙及温室生测的方法筛选生防菌,通过形态学及gyr B基因序列同源性分析对生防菌株进行鉴定;采用鉴别性培养基测定生防菌的拮抗因子(纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶);测定生防菌发酵液对西瓜枯萎病菌孢子萌发及菌丝生长的影响;于田间条件下检测该菌株防治西瓜枯萎病的效应。【结果】筛选到了一株对西瓜枯萎病具有防治效果的拮抗菌株SFJ11,经鉴定该菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。该菌株可以分泌蛋白酶和纤维素酶,其20%的发酵液几乎能完全抑制西瓜枯萎病菌菌丝的生长,对孢子萌发的抑制率为95%,田间防治效果最高可达78%。【结论】菌株SFJ11对西瓜枯萎病具有较强的生防效果,有潜在的应用价值。     

连作西瓜抗逆系统及土壤微生态对大蒜伴生的响应

以大蒜-西瓜化感伴生栽培模式为研究对象,设置连作西瓜单作(对照)、大蒜苗期伴生连作西瓜、大蒜全生育期伴生连作西瓜3个处理,考察西瓜枯萎病发病率,西瓜叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量,以及根际土壤酶活性和微生物数量,探索大蒜伴生对西瓜酶促抗氧化系统及土壤特性的影响。结果表明:(1)大蒜-西瓜伴生栽培体系中,西瓜枯萎病发病率比单作对照显著降低,且全生育期伴生处理效果更好。(2)大蒜-西瓜伴生栽培的西瓜叶片抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶)活性均比连作单作对照显著增加,且全生育期伴生处理增幅更大。(3)大蒜-西瓜伴生栽培的西瓜叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量比单作对照显著增加,而其脯氨酸含量显著减少,且全生育期伴生处理变化幅度更大。(4)大蒜-西瓜伴生栽培的西瓜根际周围土壤真菌、尖孢镰刀菌数量比单作对照显著减少,而其细菌和放线菌数量显著增加;同时其西瓜根际周围土壤多酚氧化酶、过氧化物酶、脲酶活性比单作对照增加,而蔗糖酶活性显著降低。研究发现,大蒜-西瓜伴生栽培能够显著降低西瓜连作枯萎病的发病率,增强西瓜植株叶片抗氧化酶活性,提高植株叶片渗透调节物质含量,并有效改善根际周围土壤菌落平衡和土壤酶活性,从而提高了连作西瓜抗性和根际土壤质量,有效破除了西瓜连作的障碍。