实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究

转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键．利用高通量、快速、灵敏的SYBR Green Ⅰ荧光定量实时PCR法,检测了转大麦烟酰胺合成酶基因（NASl）水稻中外源基因拷贝数．以蔗糖磷酸合成酶基因（SPS）作为水稻的内源参照基因．通过梯度稀释法．分别获得了NAS1和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线,相关系数分别为0．99976和0．99571,相关性高．通过目的基因NAS1和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较,获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数。在8株转基因株系中,1株为假阳性,1株拷贝数为1,3株拷贝数为2,其余3株拷贝数分别为3、4和7．而阴性对照拷贝数为0．这种方法快速、简便、准确,可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择．     

实时荧光定量PCR(TaqMan)法测定外源基因的拷贝数

实时荧光定量PCR是近年新兴的一项技术,因其快速、方便、便宜,需要DNA样品量少,无需放射性检测等优点被广泛应用于基因的定量分析。该文就实时荧光定量PCR(TaqMan)技术的发展、基本原理及测定外源基因拷贝数的技术流程做一介绍。     

利用荧光定量PCR分析c-Ha-ras基因在C57-ras转基因小鼠中的拷贝数

目的:利用real-time PCR建立检测C57-ras转基因小鼠中外源c-Ha-ras基因拷贝数的简便方法,为药物安全性评价C57-ras转基因小鼠模型的繁殖和筛选提供数据支持。方法:以自建的人原癌基因c-Ha-ras转基因小鼠为研究对象,利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的绝对定量法测定3个C57-ras转基因小鼠系的c-Ha-ras基因Ct值,通过与内参基因GAPDH比较计算获得转基因的拷贝数。结果:内参基因GAPDH的标准曲线为lg NGAPDH=-2.852Ct+26.236,外源基因c-Ha-ras的标准曲线为lg NRAS=-3.068Ct+39.186;经计算,NO.2、NO.3、NO.5系的F6代拷贝数分别为4、4和3,并且系内不同个体间拷贝数一致。结论:利用SYBR GreenⅠreal-time PCR技术建立了检测C57-ras转基因小鼠中外源基因拷贝数的方法,该方法操作简单,节约成本,为C57-ras致癌性模型的选留和应用提供了基础和技术手段,也为其他类似转基因品系中转基因拷贝数的确定提供了一种参考方法。     

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆

针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR GreenⅠ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测。该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼外源基因拷贝数的测定

目的:测定转红色荧光蛋白基因唐鱼的外源基因拷贝数。方法:以杂合F5代和杂合F6代转红色荧光蛋白基因唐鱼为材料,以其外源插入片段(pDsRed-mylz2)与基因组插入位点5′侧翼区之间的边界序列作为特异性内参片段,同时以外源整合的红色荧光表达载体序列(pDsRed-mylz2)作为目的基因,采用实时荧光定量PCR技术测定外源基因整合的拷贝数。结果:运用外源基因与特异内参在同批次实时荧光定量PCR中的初始拷贝数比值,得到杂合F5代和杂合F6代转红色荧光蛋白基因唐鱼中插入的外源红色荧光表达载体序列pDsRed-mylz2的拷贝数均值均为3。结论:转红色荧光蛋白基因唐鱼的外源基因拷贝数为3。     

实时荧光定量PCR技术及其在植物转基因产品检测中的应用

实时荧光定量PCR技术因其实时、快速、高效和准确定量的优点,已经广泛用于转基因产品定量检测。本文介绍荧光定量探针技术的原理、特点及其在植物转基因产品检测中的应用情况。     

REAL-TIME PCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数

采用SYBR GreenⅠ real-time PCR方法检测7株转基因小麦中外源半夏凝集素基因的拷贝数。以小麦蜡质基因（wx012）作为内参基因,以未转基因小麦基因组DNA为内参基因标准品进行5倍梯度稀释得到内参基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2667x+6.98;以含半夏凝集素基因（pta）的质粒DNA为目的基的因标准品同样进行5倍梯度稀释,建立目的基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线：y=-0.2118x+4.53。通过SYBR GreenⅠ real-time PCR分别获得每一样本中目的基因和内参基因的CT值,将CT值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量,目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因植株中的拷贝数。计算结果为：单拷贝的有1株,2个拷贝1株,3拷贝和4拷贝的各有2株,其中有1株为假阳性植株。     

应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦

目的:对转入高分子量谷蛋白亚基的小麦中转基因成分进行实时荧光PCR定性定量检测。方法:针对转基因小麦品系中通用的ubiquitin启动子,NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为小麦物种内源特异参照基因,用单粒B73转基因小麦提取基因组DNA建立内源基因和外源基因的标准曲线,对转基因小麦样品A进行定量检测,同时优化实时荧光PCR条件反应条件。定量检测结果为5.35%。结果:研究的实时荧光PCR技术对转基因小麦中转基因成分能够快速准确地进行定性定量检测。     

Simple Method of Zygosity Identification in Transgenic Mice by Real-time Quantitative PCR

To determine zygosity in transgenic (Tg) mice, a new technology, real-time quantitative PCR, has recently been introduced in transgenic research to overcome several drawbacks (time-consuming, specialized techniques and/or ambiguity in the results) of previously established methods, for example, Southern blot hybridization, dot blot hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH), etc. However, the previous real-time quantitative PCR method still possesses several drawbacks, for example, it needs two sets of primers/probes and the complicated setting up of appropriate conditions, both of which are expensive and remain time-consuming. We therefore developed an improved real-time quantitative PCR system for determination of zygosity, which is easy, rapid and less expensive, because the technique needs only two experimental processes: estimation of DNA concentration and CYBR Green PCR. We found that homozygous, hemizygous and non-Tg animals could easily be distinguished among F1 littermates in crosses of hemizygous EGFP- and DsRed2-Tg mice. Our improved method will be applicable to any Tg mouse strains, when a primer set is matched to the corresponding transgene.     

枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的:建立枣疯病植原体拷贝数检测实时荧光定量PCR方法,为枣疯病植原体定量检测提供技术支持。方法:构建质粒标准品,设计实时荧光PCR探针引物,优化体系,建立标准曲线,并进行重复性验证。结果:制备了枣疯病植原体标准质粒,建立了稳定的质粒标准品检测体系(R2=0.998,检测限10拷贝,定量限100拷贝)。结论:实时荧光定量PCR检测方法重复性好,可用于枣疯病植原体的拷贝数检测,为枣疯病植原体检验检测和病害防治提供了技术支持。     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）准确性的先决条件。该文以茶树（Camellia sinensis）芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时,可选择β-actin作为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

实时荧光定量PCR及其在传染性疾病检测中的应用

实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。与普通的PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。我们综述了实时荧光定量PCR技术的原理、定量方法,及其在传染性疾病检测研究中的应用。     

Simple Identification of Transgenic Arabidopsis Plants Carrying a Single Copy of the Integrated Gene

Transgenic Arabidopsis thaliana plants carrying a single copy of integrated DNA can be identified by single-step genomic polymerase chain reaction. The reaction employs two sets of primer pairs with the same melting temperature that amplify the amplicons derived from the integrated T-DNA together with those from an endogenous single-copy gene as a reference. When the band intensity ratio is one, this means that the transgenic plants are carrying a single copy of the integrated gene per haploid.     

转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR（hiTAIL-PCR）技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量PCR有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hiTAIL-PCR对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。