理化因素对ALDC热稳定性的影响

用多种物理因素和化学因素包括蛋白质稳定剂等对α 乙酰乳酸脱羧酶进行热稳定性试验 ,结果发现稳定剂A ,B和C可明显提高α 乙酰乳酸脱羧酶的耐热性。在此基础上 ,通过正交试验得出一个复合稳定剂的最佳组合配比A1B3 C2 。该组合试验中残余酶活高达 99.4 % ,而对照组仅为 17.4 %。     

雄激素受体辅助调节因子267-α的相互作用蛋白

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-α (androgen receptor-associated coregulator 267-α, ARA267-α)的功能, 以含有编码ARA267-α中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒, 采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质. 在筛选文库的阳性克隆中, 经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对, 发现死亡受体-6(death receptor-6, DR6)是ARA267-α-PHD-SET的相互作用蛋白之一. 通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-α的PHD-SET结构域相结合. DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一, 它的胞内区含有死亡结构域, 参与细胞凋亡信号的传导. 这个研究结果提示: 有ARA267-α参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-α和DR6的相互作用而产生交叉联系.     

回转对COL1A1-EGFP基因表达的影响

研究微重力对COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子活性的影响,探讨微重力对成骨细胞相关基因表达影响的作用机制.将长为3.6 kb COL1A1启动子双酶切,获得不同长度的启动子片段,并与报告基因EGFP(增强型绿色荧光蛋白)连接,转染ROS17/2.8细胞,用G418筛选,得到稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株.利用回转器模拟微重力效应,体外培养条件下,观察各细胞株报告基因的表达情况.结果显示细胞在模拟微重力下培养24,48 h后,报告基因EGFP和Ⅰ型胶原的表达升高,表明COL1A1启动子活性增强.说明短期模拟微重力条件下,成骨细胞能通过增强COL1A1启动子活性,代偿性提高Ⅰ型胶原的表达.     

借助计算机模建与缺失突变技术确定抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位

钓取抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)抗体Z12重、轻链可变区(VH, VL)基因, 根据其氨基酸序列, 运用同源模建方法分别模拟VH和VL结构域的空间构象, 并搭建Fv片段的整体三维结构, 利用分子对接方法建立Fv/hTNF-α作用的复合物模型, 据此模型推测Z12抗体识别的表位为hTNF-α141~146位. 将hTNF-α分为N端1~91和C端92~157两段进行原核表达, 检测结果表明Z12抗体识别的抗原表位位于hTNF-α C端92~157区, 初步证实预测结果可靠. 进一步的实验研究表明, 当把hTNF-α141~146位氨基酸缺失后, Z12抗体识别该缺失体的能力几乎丧失, 提示此抗体特异性识别抗原分子141~146位氨基酸残基.     

野生苋属植物籽实中新型α淀粉酶抑制剂的分离纯化及其性质研究(英文)

从野生苋属植物 (Amaranthuspaniculatus)籽实中分离纯化出α淀粉酶的一种新型蛋白质类抑制剂 .该抑制剂被命名为WAI 1 .MALDI TOF质谱测得其分子量为 986 5 ,是目前报道的α 淀粉酶的蛋白质类抑制剂中分子量最小的 .初步的组成和结构分析结果表明 ,WAI 1由 9个氨基酸残基组成 ,其N端为焦谷氨酸 .直接用RP HPLC纯化后 ,WAI 1能在弱酸性条件下 ,以非竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道α淀粉酶的活性 ,最适抑制pH 6 0 ,但对人唾液淀粉酶活性无影响 .WAI 1在 37℃下与酶预温浴约 30min后显示最大抑制活性 .当α淀粉酶用量一定时 ,α淀粉酶活性的抑制率在约 5 0 %的范围内随抑制剂 酶比例的增大而呈线性增加 ,超过 5 0 %后 ,抑制率随抑制剂 酶比例的增大而缓慢上升 ,最终达到最大值 (约 6 5 % ) .     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coli M15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

稳定干扰素的-α-2b多糖玻璃体颗粒的研究

目的:在温和条件下,将结构脆弱的干扰素-α-2b制备成可耐受苛刻制荆条件的微粒.方法:通过干扰素在多糖和PEG共溶液中的冷冻相分离作用,制备干扰素分配在多糖分散相的微粒.在显微镜和扫描电镜下观察了颗粒的大小和外观,同时将颗粒置于不同密度的溶剂中考察了密度.用MicroBCA和ELISA法测量了颗粒的包封率和载药量;用SEC-HPLC和细胞病变抑制法初步考察了颗粒制备后蛋白稳定性的变化.结果:颗粒表面光滑圆整,粒径约1～5μm,密度约为1.47～1.48 g/cm3,说明颗粒结构致密.MicroBCA和ELISA法测量的包封率分别为90%和80%以上,SEC-HPLC法测定蛋白无明显聚集体产生,细胞病变抑制法得出的活性保留率80%左右.结论:冷冻相分离法是一种简单但有效的制备蛋白多糖颗粒的方法.颗粒粒径均一,形态规整.该方法可进一步应用于蛋白缓释及微粉吸入等剂型的研究.     

脂联素基因多态性、肿瘤坏死因子-α与儿童肥胖症

脂联素(ADPN)是一种主要由脂肪细胞分泌的特异性细胞因子,参与机体的糖和脂肪代谢,随着脂肪组织的增多ADPN水平下降。人群中脂联素基因序列中存在相当数量的等位基因单核苷酸多态性(SNPS),脂联素基因的SNPs与儿童肥胖关系密切。肥胖儿童中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平升高,限制肥胖的发展。脂联素和肿瘤坏死因子-α在机体内可相互影响表达,共同参与儿童肥胖的形成。