解脂耶罗维亚酵母工程菌合成超长链脂肪酸及温度的影响

[背景]解脂耶罗维亚酵母属于产油微生物,大量研究表明该酵母能够高产长链脂肪酸和油脂,但是应用该酵母合成超长链脂肪酸仍待研究。[目的]工程化解脂耶罗维亚酵母合成高值超长链脂肪酸,并研究温度对脂肪酸合成的影响。[方法]合成密码子优化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)延长酶基因AtFAE1、非洲芥菜(Brassica tournefortii)延长酶基因BtFAE1和碎米芥属植物Cardamine graeca的延长酶基因CgKCS,分别构建质粒pYLEX1-AtFAE1、pYLEX1-BtFAE1、pYLEX1-CgKCS和pYLEX1-AtFAE1-BtFAE1-CgKCS。以解脂耶罗维亚酵母菌株Po1g为宿主,通过化学法分别转化上述4个质粒,获得工程菌Po1g-AtFAE1、Po1g-BtFAE1、Po1g-CgKCS和Po1g-AtFAE1-BtFAE1-CgKCS,比较评价超长链脂肪酸的合成。在此基础上,过表达内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT1(diacylglycerol acyltransferase)提高产油量,并研究温度对生物量、产油、脂肪酸组成的影响。[结果]在解脂耶罗维亚酵母中3个延长酶的延长能力明显不同,AtFAE1主要催化C20:1脂肪酸的合成,BtFAE1更有利于芥酸(C22:1)的合成,而CgKCS能够催化合成神经酸(C24:1),但是三者共表达并未提高神经酸产量。在表达CgKCS基因的菌株中过表达DGAT1基因,细胞油脂含量提高50%。温度实验表明,低温有利于解脂耶罗维亚酵母合成不饱和脂肪酸,反之,高温利于其合成饱和脂肪酸。[结论]脂肪酸延长酶基因CgKCS可直接催化C18:1脂肪酸合成C24:1的超长链脂肪酸,并且通过优化培养温度可提高不饱和脂肪酸的合成。本研究为构建超长链脂肪酸细胞工厂以及发酵优化提供理论和技术参考。     

肠道菌与氯离子通道介导的肠道液体分泌关系

肠道具有人体最庞大、最复杂的微生物群体,在人体健康中扮演着重要的角色。肠道液体的分泌主要通过肠上皮氯离子通道介导,其过度激活或缺陷均能够引起肠道疾病,进而影响肠道微生物;相反,一些肠道菌也会直接或间接影响氯离子通道的表达与功能,危害机体健康。本文将对肠道菌、氯离子通道以及二者关系研究进展进行概述。     

肠道菌群多糖利用及代谢

宿主与肠道共生菌之间存在一种互利共生的关系。肠道共生菌可以代谢宿主自身不能消化的多糖。进入肠道内的多糖是影响肠道共生菌生理状态和组成的重要因素,这些多糖主要来自饮食和宿主的粘膜分泌物。人类饮食中含有几十种不同的膳食多糖,其中大多数不能被人类基因组中编码的酶降解,并进入大肠,供肠道共生菌利用。肠道共生菌将这些不易消化的多糖转化为短链脂肪酸,作为大肠细胞和其他肠道上皮细胞的营养物质。除此之外,短链脂肪酸对人体健康有着重要的影响。不同的肠道共生菌对进入肠道内的多糖具有不同的偏好性,表明摄入膳食多糖是一种可以直接影响肠道内共生菌物种平衡的策略。因此,研究肠道菌群的多糖代谢机制具有重要的意义。本文从肠道共生菌的组成、利用进入肠道内多糖的机制,以及产生的代谢产物可能对人体健康存在的潜在影响等方面进行了综述,并介绍了代表性的肠道共生菌如拟杆菌和双歧杆菌利用多糖的途径及特征。     

应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

花椒果皮中总黄酮与多酚的积累及其抗氧化活性研究

以7年生花椒为试材,研究不同生长时期花椒果皮的总黄酮、总多酚含量的变化以及二者与抗氧化能力的关系.结果显示:(1)在花椒果实发育过程中,花椒果皮黄酮与多酚均有积累,总黄酮含量随果实的成熟程度不断增加,于成熟期(8月1日)黄酮含量达到最大值(164.14 mg/g);但多酚含量在果实发育早期迅速上升,于6月30日达到最大值(77.17 mg/g)后快速下降,至成熟期(8月1日)多酚含量为46.23 mg/g.(2)不同时期的花椒果皮均具有还原力及羟基自由基清除能力,且二者随果实生长的增加而提高,且总黄酮、多酚含量均与还原力和羟基自由基清除能力之间呈显著正相关关系,相关系数分别为0.977、0.960和0.917、0.933.研究表明,成熟花椒果皮中总黄酮含量达到最高,多酚含量也较高,而且黄酮和多酚类物质是花椒果皮抗氧化活性的主要功效成分.     

油棕（Elaeis guineensis）中果皮发育过程中miRNA的表达动态分析

以CTAB法提取油棕（Elaeis guineensis）中果皮5个不同发育时期（G1～G5）的小RNA。从前期研究获得的油棕小RNA测序数据库中筛选12个候选miRNA,实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测其在果实发育过程中的表达量变化,并进一步对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果表明：中果皮5个不同发育时期小RNA的OD260/OD280比值在1.7～2.0之间;浓度分别是289、364、476、213、390 ng/μL;qRT-PCR检测结果显示,12个候选miRNA在5个发育时期均显著性差异表达,特别是在中果皮发育第4个时期（G4）和第5个时期（G5）表达量极显著增高,其中miR395和miR156在第4个时期表达量最高;miR395和miR528在发育第5时期表达量最高;靶基因预测结果显示差异表达的部分miRNA,其靶基因可能参与了脂肪酸代谢通路,如磷脂酸磷酸脂酶和磷脂酶D。本研究筛选的与脂肪酸代谢相关的miRNA为今后油棕脂肪酸代谢调控通路研究提供了可能的线索。     

元宝草中一个新的二苯甲酮

为了研究元宝草(Hypericum sampsonii Hance)全草的化学成分,利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20等色谱技术对元宝草三氯甲烷部位进行分离和纯化,共得到6个化合物,通过1H NMR、13C NMR、HMQC、HMBC等波谱技术分别鉴定为2,6-二羟基-4,3’,5’-三甲氧基二苯甲酮(1)、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌(2)、山奈酚(3)、木犀草素(4)、3,4-二羟基苯甲酸乙酯(5)、β-谷甾醇(6),其中化合物1为新化合物,化合物2和5首次从该植物中分离得到。     

脂肪酸合成系统潜能的挖掘与释放

在全球石油资源不断减少和温室气体不断积累的情况下,急需发展可再生燃料能源及各种生物化工原料和产品。基于该目的,能够生产高能量密度液体生物燃料和高附加值化工品的微生物脂肪酸合成系统备受关注。首先介绍了大肠杆菌脂肪酸代谢系统的组成,然后详细总结了通过改造脂肪酸代谢途径生产脂肪酸以及脂肪酸衍生物的最新研究进展,并介绍了利用体外重建体系来研究脂肪酸合成途径对该系统进行深入挖掘,以及根据得到的信息指导体内脂肪酸途径的改造来释放脂肪酸合成系统的潜能。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制

目的：利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗,研制定量检测心肌型脂肪酸结合蛋白（ H-FABP ）的ELISA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠,以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗,用这些单抗研制定量检测H-FABP的ELISA 试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株,研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒,灵敏度达到0．2 ng/mL,线性范围0．4～25 ng/mL,r2＝0．9967,回收率在97．2％～104．5％,精密度的变异系数（CV）≤6．72％;应用此试剂盒检测健康人血浆H-FABP,含量为1．87～8．50 ng/mL。结论所研制的ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中H-FABP含量的检测。     

羟基磷灰石义眼台植入联合一期钛钉打孔术的效果研究

目的：探讨国产医用钛钉系统联合改良羟基磷灰石义眼台钛钉打孔术的手术效果。方法：选择32只健康家兔并将其分两组,在球内容摘除术后分别行单纯义眼台植入及义眼台植入联合一期钛钉打孔术,于2、4、6、12w时每组分别处死4只家兔,观察和评价家兔对钛钉的生物耐受性及HA植入物的血管化过程。以动物实验为基础,对87例患者行羟基磷灰石义眼台一期植入联合钛钉打孔术,随访12个月,观察其手术效果及与此术式相关的并发症,总结分析国产医用钛钉系统联合改良羟基磷灰石义眼台钛钉打孔术的手术效果及优点。结果：动物实验显示：一期钛钉植入术未发生钛钉移位、排斥,扫描电镜结果表明：2、4、6、12w时两组HA血管化过程无显著差异,6w时钛钉周围1mm范围内与其完全对应的环行区域内血管化程度没有显著差异。临床实验显示：改良术式与二期打孔术相比,义眼片活动度显著提高（P〈0．01）,差异有统计学意义（P〈0．05）。两组术后肉芽肿的发生率比较无统计学差异（P〉0．05）。结论：一期植入钛钉生物相容性好,改良术式临床效果佳,术后并发症少。