基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

库尔勒香梨黑头病拮抗菌的筛选和鉴定

【背景】库尔勒香梨黑头病是近年来发现的一种由芸薹生链格孢菌(Alternaria brassicicola)XL2引起的采后病症,由于其高侵染率和高腐烂率造成了极大的经济损失,目前已成为库尔勒香梨采后储运的主要防治病症之一。【目的】发掘高效的库尔勒香梨黑头病拮抗菌,探索拮抗菌株的抑菌作用,为其生物防治提供潜在资源菌。【方法】从采后健康果蔬表面分离不同微生物,采用平板对峙法,以A.brassicicola XL2为靶标菌筛选具有拮抗作用的菌株,结合形态学观察、生理生化检测和16S rRNA基因序列分析鉴定拮抗菌株分类地位;检测拮抗菌无菌滤液对A. brassicicola XL2的抑制效应,显微观察拮抗菌对A.brassicicola XL2菌丝生长的影响;验证拮抗菌发酵液在库尔勒香梨果实上的抑菌活性。【结果】从新疆油桃表面分离获得90株菌,其中菌株Y2对A. brassicicola XL2有较强拮抗作用,经鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株Y2的无菌滤液对A. brassicicola XL2菌落生长具有明显抑制作用,2%的无菌滤液抑菌率达到70.96%;Y2无菌滤液造成A.brassicicola XL2菌丝扭曲变形、分枝增加、尖端出现致密结构等异常现象;Y2发酵液和无菌滤液明显抑制A.brassicicola XL2的孢子萌发;Y2发酵液在库尔勒香梨果实上具有较高抑菌活性,对库尔勒香梨病斑直径抑制率达到37.66%,深度抑制率达到42.74%。【结论】枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Y2能有效抑制A. brassicicola XL2的生长,对库尔勒香梨黑头病具有显著的生物防治效果。     

昆虫病原真菌长孢蜡蚧菌TF-2菌株对豌豆蚜的侵染过程和致病力

【目的】豌豆蚜Acyrthosiphon pisum是世界性的重要农业害虫,给豆类作物造成巨大的经济损失。本研究在前期筛选已获得豌豆蚜致病菌长孢蜡蚧菌Lecanicillium longisporum TF-2菌株的基础上,检测了该致病菌分生孢子对豌豆蚜的毒力效用及侵染方式,以期为利用昆虫病原真菌防治豌豆蚜提供理论基础。【方法】采用离体叶片饲养法检测在不同浓度长孢蜡蚧菌TF-2菌株孢子悬浮液(1.0×10~3～1.0×10~7孢子/mL)中浸渍后对豌豆蚜成虫的致病力;应用扫描电镜和体视显微镜观察豌豆蚜成虫接种TF-2菌株(1.0×10~7孢子/mL)后长孢蜡蚧菌TF-2菌株侵染症状和侵染过程。【结果】不同浓度长孢蜡蚧菌TF-2菌株分生孢子浸染豌豆蚜成虫致病力随分生孢子浓度升高而逐渐增强,侵染后6 d对豌豆蚜成虫的半致死浓度(LC_(50))为3.26×10~4孢子/mL,最高浓度分生孢子(1.0×10~7孢子/mL)对豌豆蚜成虫的半致死时间(LT_(50))为2.92 d。扫描电镜观察结果表明,接种后24 h,TF-2菌株分生孢子在豌豆蚜成虫体表皮萌发形成芽管和附着胞;接种后48 h,芽管伸长在复眼、触角基部、足基节、腹末生殖节等部位形成网络结构;接种后96 h,菌丝布满整个虫体,新的分生孢子产生。【结论】长孢蜡蚧菌TF-2菌株对豌豆蚜成虫具有较强的致病力,扫描电镜观察揭示了其分生孢子在其虫体上的侵染过程,结果为进一步应用昆虫病原真菌进行生物防治提供理论基础和参考依据。     

一株侵染豌豆蚜的昆虫病原真菌的分离及鉴定

【目的】从采集到的自然染菌的豌豆蚜Acyrthosiphon pisum虫尸分离纯化得到一株病原真菌,定名为TF-2。本研究旨在确定该菌株的分类地位,为豌豆蚜生物防治提供真菌资源。【方法】对自然染菌的豌豆蚜虫尸上寄生真菌TF-2进行回接试验,分离纯化出致病菌株TF-2;在显微镜下配制TF-2菌株不同浓度孢子悬浮液,采用浸渍法和离体叶片饲养法测定其对豌豆蚜成虫的毒力;利用光学显微镜观察菌株形态学特征。PCR扩增TF-2的rDNA-ITS序列并测序,构建系统发育树对TF-2菌株进行分子鉴定。【结果】毒力测定结果表明,TF-2菌株对豌豆蚜成虫表现出很强的致病力,1×10^7孢子/mL处理6 d后豌豆蚜成虫校正死亡率达到100%。TF-2在PDA培养基上菌落呈圆形,白色或淡黄色毡状,菌落背面呈奶油色;菌株孢梗呈瓶状,在菌丝上单生或侧生2~3个,大小为(19-42)μm×(1.1-2.5)μm,基部较粗至尖端逐渐变细,分生孢子长椭圆形,大小为(4.2-11.8)μm×(1.6-2.6)μm。菌丝体产生晶体呈八面体。该菌株的rDNA-ITS序列与长孢蜡蚧菌Lecanicillium longisporum(GenBank登录号:KX426564)的rDNA-ITS核苷酸序列一致性达99%,位于系统发育树的同一分支。【结论】菌株TF-2被鉴定为豌豆蚜的病原真菌长孢蜡蚧菌L.longisporum,对豌豆蚜的生物防治具有潜在的应用价值。     

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导矿化回收稀土离子La(Ⅲ)

[目的] 从罗源湾红树林浅滩土壤中筛选出产脲酶真菌,研究其对镧La（Ⅲ）的最大耐受浓度,利用其吸附和产脲酶作用诱导矿化回收稀土离子La（Ⅲ）,以期为稀土离子La（Ⅲ）的资源回收提供菌种资源和应用技术指导。[方法] 从罗源湾红树林浅滩土壤中分离、筛选、纯化出可产脲酶及耐La（Ⅲ）真菌,通过ITS rDNA基因序列分析对其进行鉴定;同时,利用XRD、SEM-Mapping及FT-IR分析探讨菌株回收La（Ⅲ）的机理。[结果] 经分离、纯化得到一株可产脲酶及耐受高浓度La（Ⅲ）的真菌FZU-07,鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,其具有较强诱导矿化回收La（Ⅲ）的能力,对La（Ⅲ）的最大耐受浓度为400 mg/L。菌株FZU-07单独对La（Ⅲ）吸附回收效率为46.19%;在诱导矿化条件下回收效率可提高到99.16%。FT-IR和SEM-Mapping分析表明,尖孢镰刀菌吸附La（Ⅲ）与菌丝体表面的氨基、羟基、羰基和磷酸基团相关;XRD和SEM-Mapping结果表明诱导矿化是通过该菌的产脲酶特性,使尿素分解产生碳酸,并与钙离子结合生成球霰石晶型的碳酸钙,La（Ⅲ）被捕获在球霰石晶格中,形成La（Ⅲ）和碳酸钙的混合固相,以共沉淀的形式被回收。[结论] 菌株FZU-07,是一株具有产脲酶特性的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,且具有较强的诱导矿化回收La（Ⅲ）能力。表明微生物诱导碳酸钙沉淀是一种可行且生态友好的回收稀土离子的方法。     

产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件优化

[目的]通过优化内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件,提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ (10-DAB)和紫杉醇(Taxol)的产量.[方法]采用单因素试验分析不同的培养基初始pH值、培养温度、摇床转速和培养时间对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养条件;以YES为基本培养基,采用单因素试验和正交试验分析添加苯甲酸钠、苯丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸4种前体物对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养基组分.[结果]优化后发酵条件为:在初始pH为5.0的300 mL YES培养基中,添加15 mg/L苯甲酸钠、25 mg/L苯丙氨酸、5 mg/L丝氨酸、15 mg/L甘氨酸,接种1 mL枝状枝孢霉MD2的孢子悬液(107-10s个孢子/mL),28.0℃、220 r/min发酵培养12d.在此条件下,枝状枝孢霉MD2的生物量、10-DAB和紫杉醇的产量分别为15.5 g/L、471.5 μg/L和569.5 μg/L,与初始发酵条件相比,分别提高了1.3、3.6和3.4倍.[结论]首次获得了枝状枝孢霉MD2生产10-DAB和紫杉醇的较适摇瓶发酵条件,可为进一步放大发酵培养提供参考.     

岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2的克隆及表达特性分析

类萌发素蛋白是植物中普遍存在的一类可溶性糖蛋白,在植物抗逆胁迫中起着重要作用。依据岷江百合编码GLP的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从岷江百合犯ilium regale Wilson）克隆得到一个新的GLＰt基因的全长eDNA序列,命名为LrGLP2。LrGLP2全长cDNA为921bp,含有654bp的开放阅读框,49bp5’非编码区以及218bp3’UTR,编码217个氨基酸的蛋白质。LrGLP2编码蛋白质与已知植物GLPs家族成员间的同源性和聚类分析表明LrGLP2与来源于水稻（Oryza sativa）、节节麦似egilopstauschii）、葡萄（Vitis vinifera）中的GLPs具有较高的相似性。qRT-PCR分析显示,LrGLP2在岷江百合正常生长发育的根中有一定量的表达,而在茎和叶中几乎检测不到表达量。水杨酸、茉莉酸以及H202处理均不同程度抑制LrGLP2的转录水平,但乙烯处理能明显诱导LrGLP2的表达。此外,岷江百合接种尖孢镰刀菌（Fusari—umoxysporumfsp．tiliO后,LrGLP2在接种后2h表达迅速上调,12h表达量急剧上升,至24h表达量达到最大值,之后表达量下降,可见￡rGLP2参与岷江百合对尖孢镰刀菌的防卫反应。     

植物细胞工程技术生产紫杉醇研究进展

紫杉醇是一种二萜类生物碱,主要从红豆杉树皮中分离提取。目前采用植物细胞工程技术是提高紫杉醇产率、保护稀缺资源红豆杉、解决紫杉醇药源紧缺的一种最有效方法。该文对近十年来国内外有关采用植物细胞工程技术生产紫杉醇的研究进展,包括红豆杉细胞系的建立、悬浮培养条件的研究、生物反应器培养以及紫杉醇合成代谢调控方面的最新研究进展进行综述。并重点论述了前体、诱导子和代谢支路抑制剂对红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的影响,为植物细胞工程技术生产紫杉醇提供借鉴和参考。     

海洋来源小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160中大环内酯类化合物的分离鉴定

放线菌SCSIO N160是从南海海底沉积物中分离到的一株小单孢菌.从Micromonospora rosaria SCSIO N160的发酵液中,我们分离纯化了四个大环内酯类抗生素,通过质谱与核磁共振1H、13C NMR谱的解析,确定为rosamicin(1)、6108B(2)、M-4365 A1(3)和M4365-G1 (4).     

4种红豆杉属植物遗传多样性和遗传关系的RAPD分析

采用RAPD标记研究了分属于4种红豆杉属(Taxus Linn.)植物的68个单株的遗传多样性,并采用UPGMA方法分析68个单株的遗传关系.结果表明:12条RAPD引物共扩增出109条带,其中多态性条带108条,多态性条带百分率为99.1％;平均每条引物扩增出9.1条带.南方红豆杉[T.wallichiana var.mairei (Lemée et Lévl)L.K.Fu et Nan Li.]种内的多态性条带百分率和观察等位基因数均最高;欧洲红豆杉(T.baccata Linn.)种内的有效等位基因数、Nei's基因多样度和Shannon's信息指数均最高;须弥红豆杉(T.wallichiana Zucc.)种内的各项遗传多样性指数均最低.供试4种植物的种内遗传多样度、种间遗传多样度、基因流和种间遗传分化系数分别为0.1745、0.358 6、0.401 7和0.554 5,表明55.45％的遗传变异发生在种间.南方红豆杉和须弥红豆杉遗传距离最近;曼地亚红豆杉(Taxus×media Rehd.)和须弥红豆杉的遗传距离最远.通过聚类分析可将68个单株分为3组,欧洲红豆杉的18个单株和曼地亚红豆杉的18个单株分别各自聚为1组;须弥红豆杉的16个单株和南方红豆杉的16个单株聚为1组,其中须弥红豆杉的16个单株和南方红豆杉的16个单株又各自聚为1个亚组,且南方红豆杉的雌、雄单株也分别聚在同一分支上,表明须弥红豆杉和南方红豆杉遗传关系较近,而欧洲红豆杉与其他3种植物的遗传关系较远.