一种简便、高效、经济的从凝胶中回收DNA的方法

目的:尝试一种简便、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:在Eppendorf管的管底用注射器扎孔,将一小团用Eppendorf管融化后拉成的细丝放入管中,把含有DNA的凝胶放在细丝上,离心,收集从管底流出的液体,经酚氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA。结果:经过简单的离心即可近乎100%地回收凝胶中的DNA。结论:使用该方法从琼脂糖凝胶回收DNA,操作简单,回收率高,无其他试剂污染。     

琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因

采用常规的PCR方法检测低拷贝数转基因有一定困难.提出一种使用琼脂糖凝胶直接杂交的方法,结果明确、简单可行,是转基因动物中低拷贝数转基因鉴定的一种较好方法.     

共价法固定化胰蛋白酶的研究

碳二亚胺、环氧等方法研究了胰蛋白酶的共价固定化,测定了这些方法的固定化酶蛋白回收、固定化酶活力回收和固定化酶的相对比活力。实验结果表明前三种方法效果较好,蛋白回收分别为59%、93％和28％,活力回收为53％、38％和20％,考察了这三种固定化胰蛋白酶的最适温度、最适pH、表观米氏常数和工作稳定性。此外,本文对上述三种不同的固定化方法引起酶对大分子底物(偶氮酪蛋白)和小分子底物(BAPNA)的活力的影响也作了初步的探讨。     

前脑特异性CCKR-2双转基因小鼠的繁育及基因鉴定

摘要 目的：繁殖及鉴定可调控前脑特异性胆囊收缩素受体2（Cholecystokinin receptor-2,CCKR-2）双转基因小鼠（tTA/tetO- CCKR-2 double transgenic,简称dtg）,为进一步研究CCKR-2在焦虑相关疾病,如焦虑症、恐惧行为、创伤后应激障碍等发病过程中的作用及分子机制提供实验模型。方法：（1）利用α-CaMKII/tTA单转基因小鼠与tetO/CCKR-2单转基因小鼠杂交,所得子代尽可能远亲繁殖获得dtg小鼠,提取子代鼠尾基因组DNA,采用PCR法及琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物以确定其基因型;（2）采用原位杂交方法验证CCKR-2双转基因前脑特异性表达,筛选CCKR-2双转基因型及前脑特异性表达者作为继代种鼠和实验用鼠。结果：（1）PCR凝胶电泳图显示清晰的tTA（350 bp）和CCKR-2（550 bp）条带,野生型无条带显示,表明琼脂糖凝胶电泳结果与dtg模型预期基因片段大小相符;（2）原位杂交结果显示dtg小鼠前脑区域有强烈的CCKR-2表达而野生型小鼠不明显。此结果表明dtg双转基因小鼠在本实验室的成功建立与繁殖及继代,同时繁殖出更多的dtg小鼠。结论：通过正确的饲养繁育和基因鉴定方法能成功获得dtg双转基因小鼠,为本实验室进行后续相关研究奠定了基础。     

原花色素对HepS细胞增殖抑制诱导凋亡的研究

本文通过体外培养肝癌HepS细胞,以不同浓度原花色素处理12—72h后,MTT法测定细胞生长抑制作用,采用DNA片断分析、DNA琼脂糖凝胶电泳、荧光染色以及流式细胞技术等方法来探讨原花色素体外抑制肝癌HepS细胞及诱导其凋亡的作用。实验结果显示原花色素能抑制HepS细胞的生长,并且呈现出明显的时效和量效关系,DNA电泳出现典型的凋亡DNA梯形带,在荧光显微镜下,凋亡细胞呈亮绿色,H和AnnexinV．FIFC双染后,经流式细胞仪检测、分析显示凋亡细胞明显增多。因此原花色素能抑制肝癌HepS细胞株的生长,可能与诱导其细胞凋亡有关。     

一步法电泳分析肌联蛋白亚型和肌球蛋白重链

目的为研究超大分子量肌小节蛋白肌联蛋白(titin)的生理病理功能,在一次电泳过程中同时分离titin各亚型和中分子量肌小节蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)。方法使用16cm×18cm垂直电泳系统,在电泳板下1/3灌注10g/L SDS-PAGE胶,上2/3灌注60g/L SDS-琼脂糖(SDS-VAGE)胶。低温8℃下持续电泳5h,在电泳板上层以SDS-VAGE胶电泳分离titin亚型,下层以SDS-PAGE胶电泳分离MHC。电泳后VAGE胶使用银染法标记titin各亚型,PAGE胶使用考马斯亮蓝染色法标记MHC。结果 titin各亚型得到有效的分离,目标蛋白条带显示清晰,与其分子量大小一一对应,分离效果明确。结论一步法垂直电泳系统可应用于超大分子量蛋白的电泳,同时可分离多个分子量差距大的蛋白,提高蛋白电泳实验效率。     

苏云金芽孢杆菌Bt9875晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡

[目的]研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt9875菌株晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响.[方法]采用MTT比色、荧光显微观察、DNA凝胶电泳、流式细胞术等方法来检测不同浓度的Bt9875晶体蛋白处理后HL-60细胞的凋亡特征.[结果]Bt9875晶体蛋白对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100 μg/mL晶体蛋白作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解.[结论]初步证明了Bt9875晶体蛋白在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导其凋亡,这为苏云金芽抱杆菌晶体蛋白的应用开创了新的思路.     

羊栖菜多糖诱导lovo细胞凋亡及其机理探讨

本课题研究羊栖菜多糖（Sargassum Fusforme Polysaccharides．SFPS）诱导人大肠癌lovo细胞凋亡及凋亡过程中Caspase-3的变化及其意义。MTT法检测SFPS对大肠癌细胞增殖的抑制率：通过电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术鉴定细胞凋亡：应用Westernblot法测定Caspase-3酶原的变化：RT—PCR检测Caspase-3mRNA表达。结果显示：SFPS作用lovo细胞24,36,48和72h的IC50分别为375,355,178和60mg／L,表明对lovo细胞具有显著生长抑制作用。在电镜下,可见明显的细胞凋亡特征：细胞膜表面微绒毛减少、染色质固缩、边集,凋亡小体形成。在琼脂糖凝胶电泳中,药物浓度为5—300mg／L作用24h后,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带：而500mg／L处理后梯状条带模糊,开始出现“涂片状”,表明在高药物浓度的作用下,细胞有坏死。流式细胞仪测得细胞凋亡率有剂量的依赖性;DNA直方图出现亚G1峰,但细胞周期时相的分布无明显改变。SFPS处理lovo细胞后,发现Caspase-3酶原蛋白表达降低,Caspase-3的mRNA高表达,并具有剂量和时间的依赖性。实验结果提示,SFPS在体外能够诱导lovo细胞凋亡,这可能是SFPS抑制肿瘤增殖的机制之一．而Caspase-3的活化参与了SFPS诱导lovo细胞凋亡的调控。     

人G6PD T279A和T279S两种突变子的体外构建

目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.     

从琼脂糖电泳凝胶中回收DNA的几种简便方法

介绍两类从普通琼脂糖电泳凝胶中回收ＤＮＡ的简便、快捷、高效且廉价的方法．第一类为电泳洗脱法．方法ａ：利用１．５ｍＬ微量离心管、ｌｍＬ吸头、尼龙网膜和透析膜做成的一个小装置,快速有效回ＤＮＡ,最终回收率为７０％左右．方法ｂ：不用ＤＥＡＥ－纤维素膜,而用透析膜在凝胶中作出横隔挡在ＤＮＡ条带前,最终回收率为５０％左右;第二类为冰冻融解法,最终回收率也在５０％左右．如果联合使用冰冻融解法和电泳洗脱法,回收率可进一步提高至９０％．