利用雨生红球藻表达系统高通量筛选活力提高的阿特拉津氯水解酶突变子

阿特拉津氯水解酶定向改造的关键是开发一种廉价的、表型改变明显的高通量筛选方法。利用高错误倾向PCR和DNA洗牌相结合的突变方法,对来源于假单胞菌ADP和节杆菌AD1的阿特拉津氯水解酶基因进行随机突变,以雨生红球藻为受体、以阿特拉津为选择压力对突变文库进行高通量筛选。筛选到的12个突变子序列分析显示,突变均为点替换,位点分散在全基因上,是在高错误倾向PCR及DNA洗牌过程中逐渐累积形成的。酶活力分析显示,突变子的酶活力均高于野生株,在添加1.0 mg/L阿特拉津培养液中的活力是野生株的1.9~3.6倍,在添     

丛枝菌根真菌对滨梅扦插苗生根、生长和抗病相关酶活性的影响

研究Glomus mosseae,G.diaphanum和G.etunicatum对滨梅插条生根、生长和抗病相关酶活性的影响.结果表明:G.mosseae侵染导致最高生根百分率(47.6%),最多次生细根(20.4条),最高的根干重(0.26 g),最高的地上部分干重(3.55 g),最高的幼苗高度(51.3 cm)及...     

汞胁迫对白骨壤(Avicennia marina)幼苗生理生态的影响

为了解红树植物的重金属抗性机制,对白骨壤(Avicennia marina)幼苗进行不同浓度Hg2+(1、5、10、50、100 mg·L-1)的胁迫实验,测定并分析了Hg2+胁迫对白骨壤幼苗叶片的光合作用和抗氧化酶活性的影响.结果表明:叶片净光合速率随着胁迫时间的延长而降低,高浓度(≥150 mg·L-1)Hg2+胁迫下叶片的净光合速率低于中低浓度胁迫,且高浓度胁迫的叶片净光合速率在48 h后快速下降;叶片净光合速率与胞间二氧化碳浓度呈极显著负相关,叶绿素含量随Hg2+浓度的增加而降低.气孔导度在不同浓度胁迫下反应不同,低浓度Hg2+对白骨壤幼苗光合的影响可能是气孔因素,中高浓度Hg2+对白骨壤幼苗光合作用的抑制主要是非气孔因素.低浓度Hg2+胁迫,白骨壤幼苗叶片SOD、POD活性升高,表现了一定的抗逆性,而高浓度表现为抑制作用,基本在100 mg·L-1 Hg2+胁迫下活性达到最低值.说明Hg2+可以抑制白骨壤叶片的光合活性,高浓度Hg2+胁迫削弱了白骨壤的活性氧清除能力,植物极易受到伤害.     

重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的性质研究

溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶,已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染,但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据.现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究.检测了加入溶葡萄球茵酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑、杀菌活性.结果显示,重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状;并且重组溶葡萄球菌酶在39℃牛奶中可以稳定存放至少20 h以上,酶活性保持稳定;同时重组溶葡萄球菌酶在牛奶中对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌仍然保持了良好的抑杀菌效果.该研究为今后溶葡萄球菌酶用于奶牛乳腺炎的治疗提供参考依据.     

纳豆激酶固态发酵的参数优化

方法:在对实验室分离的纳豆激酶产生菌进行菌株鉴定及其酶学性质研究的基础上,对影响菌株固态发酵产酶的工艺参数进行了优化研究.结果:发酵温度、发酵时间及培养基碳氮比、料水比、pH对纳豆激酶的产生都有较大影响,而接种量对纳豆激酶影响较小;在优化条件下,纳豆激酶固态发酵酶活可达到8 300U/g,为已知最高纳豆激酶单位酶活.     

转cry1Ac／cpti基因水稻对土壤酶活性和养分有效性的影响

【背景】转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤酶活性和养分转化产生影响,转基因作物对土壤质量的影响是其环境安全性评价的重要方面。【方法】本研究通过田间定位试验分析了连续3a种植2种转crylAc／cpti双价抗虫基因水稻后,土壤酶活性和养分有效性等土壤质量性状的变化。【结果】在水稻各生育期内,除齐穗期转基因稻科丰8号（GM1）田的土壤酸性磷酸酶活性显著（P〈0．05）高于其受体非转基因稻明恢86（CK1）外,转基因稻GM1、GM2（Ⅱ优科丰8号）的土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活性与对应非转基因稻CK1、CK2（Ⅱ优明恢86）间均无显著差异。同时,在水稻生长过程中,土壤pH、有机质、有效氮、有效磷和速效钾等土壤理化指标在GM1和CK1或GM2和CK2间也均无显著差异。【结论与意义】连续38种植转crylAc／cpti双价抗虫基因水稻并未改变稻田土壤中主要营养元素的有效性及其相关土壤酶活性,即短期内种植转crylAc／cpti双价抗虫基因水稻不会影响土壤酶活性和养分状况。该结果为进一步评价转基因水稻的生态风险提供了一定的依据。     

慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞表达及对细胞增殖性影响的研究

目的：建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法：制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（Hsp90αE47A/psin-GFP）,包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VSV-G）。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果：转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升（为对照组的1.05±0.15倍,P〈0.05,t检验）,有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。（1.051±0.03vs1.349±0.05,P〈0.05,t检验）。结论：成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定

将人胱硫醚β-合酶(CBS)基因克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGEX-4T-1-CBS转入大肠杆菌E.coli Rosetta (DE3)菌株,构建了高效表达CBS的重组菌E.coli Rosetta (pGEX4T-1-CBS)。重组菌在0.1mmol/L的IPTG于30℃诱导16h,可溶性CBS表达量达到28mg/L培养基。将重组菌破碎后上清液经GSTrap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBS融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%CHAPS可以有效抑制酶切后CBS聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为143U/mg,终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)可使CBS单位酶活提高5.1倍,达到735U/mg。同时构建了表达CBS_1-413(删除了CBS羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌E.coli Rosetta (pETDuet-1-CBS_1-413),经过一步HisTrap Fast Flow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为965U/mg; 还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(CBL),并在此基础上建立了一种新的CBL偶联的CBS酶活性测定方法。     

Heat shock protein 90 indirectly regulates ERK activity by affecting Raf protein metabolism

Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) has been implicated in the pathogenesis of several nerve system diseases. As more and more kinases have been discovered to be the client proteins of the molecular chaperone Hsp90, the use of Hsp90 inhibitors to reduce abnormal kinase activity is a new treatment strategy for nerve system diseases. This study investigated the regulation of the ERK pathway by Hsp90. We showed that Hsp90 inhibitors reduce ERK phosphorylation without affecting the total ERK protein level. Further investigation showed that Raf, the UPstream kinase in the Ras-Raf-MEK-ERK pathway, forms a complex with Hsp90 and Hsp70. Treating cells with Hsp90 inhibitors facilitates Raf degradation,thereby down-regulating the activity of ERK.     

核基质结合区与转基因沉默

核基质结合区(matrix attachment region,MAR)又叫支架附着区(scaffold attachment region,SAIL)是染色质被限制酶消化后仍与核基质或核骨架结合的DNA序列。转基因沉默主要发生在两个水平上,一是转录水平,二是在转录后水平。位置效应是引起转录水平基因沉默的重要因素。研究发现,用MAR构建的载体能够提高转基因的表达水平,能在一定程度上克服基因沉默．降低转基因在不同转基因系间的表达差异,增强外源基因表达的稳定性。