核基质结合区对转基因表达的影响及其作用机制

核基质结合区(matrix attachment region,MAR)是一段在体外能与核基质结合的富含AT的DNA序列。研究发现MAR能使染色质形成环状结构;将其连到目的基因二侧构建载体并转至生物体中,发现它能增强基因转录表达水平及稳定性,在一定程度上降低转基因个体或细胞系之间转基因的表达水平的差异,这很可能是减低了基因沉默所致。现对MAR的序列特征、MAR对转基因表达的影响及对转基因效应的影响机制进行综述。     

核基质附着区与转基因表达

核基质附着区 (matrixattachmentregions,MARs)是与核基质 (或核骨架 )特异结合的DNA序列 ,属于非编码序列 ,富含AT。通过与核基质的结合 ,它能使染色质形成独立的环状结构 ,调控基因的转录和表达 ,减少由于位置效应引起的转基因沉默。MARs在提高转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异、抑制转基因沉默等方面起着重要的作用。就MAR的一些结构功能特征及其在基因工程中的应用等方面进行了阐述。     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区(matrix attachment region, MAR)在转基因植物中的功能,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T-DNA中, 并将报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(uidA)插入两段MARs序列之间.将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.).GUS活性检测表明,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平,平均表达水平提高2倍,最高单株活性可达10倍.并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比,表明MARs在转录水平提高基因表达.     

核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用

核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的应用是提高植物基因转化和表达效率的有效方法之一。将烟草（Nicotiana tabacum）核基质结合区TM2构建在植物表达载体pBI121上报告基因GUSA表达盒和选择标记基因NPTII表达盒的两侧翼,利用农杆菌介导的子叶浸染转化番茄（Lycopersicon esculentum）。结果表明,MAR序列能够显著提高转基因植株的转化效率和转基因的表达水平。不同长度的CaMV35S启动子比较表明,TM2的调控活性依赖于启动子的存在,并且具有一定的功能重叠。热诱导型启动子的研究表明,TM2仅提高热诱导的表达强度,而不改变启动子的热诱导表达调控特性。TM2的表达调控特性符合转基因的表达要求,该MAR序列可广泛应用于各种植物的基因工程中。     

核基质结合区提高稳定整合的CAT报告基因在NIH3T3细胞中的表达

通过PCR从人基因组扩增β珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)及β干扰素MAR,正向及反向克隆至pCAT3载体SV40启动子的上游,分别检测瞬时及稳定表达的情况下MAR在NIH3T3细胞内对CAT报告基因的影响情况。结果显示：瞬时表达情况下,反向及正向插入的MAR均不能提高CAT基因的表达;稳定整合的情况下,插入的β珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,β干扰素MAR提高3倍,反向及正向插入的MAR没有明显的差别。这表明MAR能在一定程度上提高外源基因的表达水平,并且不同的MAR对外源基因表达的影响存在差异,MAR的插入方向对外源基因的表达水平没有明显的作用。     

核基质结合区提高报告基因在稳定转化的杜氏盐藻中的表达

前期的研究从杜氏盐藻（Dunaliella salina）中分离出一核基质结合区（matrix attachment region,MAR）片段——DSM1.实验证实,它在体外能与核基质结合且具有MAR的典型特征.为研究其在转基因盐藻中的作用,构建了RbcS启动子驱动、氯霉素乙酰转移酶（chloramp henicol acetyltransferase,CAT）基因为报告基因及表达盒两侧含DSM1 MAR的表达载体.电击法转化盐藻,随机挑选20株稳定转化的盐藻藻株,分析CAT酶活性.结果表明,在稳定转化的盐藻细胞中,MAR能使报告基因CAT的表达水平比对照藻株提高1-5倍,不同藻株之间个体表达的差异性也有所降低     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregion ,MAR)在转基因植物中的功能 ,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T_DNA中 ,并将报告基因β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)插入两段MARs序列之间。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平 ,平均表达水平提高 2倍 ,最高单株活性可达 10倍。并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比 ,表明MARs在转录水平提高基因表达。     

杜氏盐藻中的核基质与核基质结合区

真核生物细胞核DNA通过核基质结合区（Matrix attachment region,MAR）附着到核基质上。为了进一步探索染色体DNA与核基质之间的相互作用,从单细胞真核藻类-杜氏盐藻中克隆出了MAR片段。首先构建了杜氏盐藻的随机MAR文库,通过体外结合实验分离出能与核基质结合的MAR序列。从构建的MAR文库中,筛选出3个能与核基质结合的MAR,其中两个片段与核基质具有较强的结合力,测序分析表明具有MAR片段的一些典型特征性基序。     

核基质结合区的位置对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (MAR）序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β 珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳离子聚合物转染CHO细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,ELISA分析CAT基因的表达水平,半定量PCR分析CAT基因相对拷贝数.结果表明,表达盒两侧含MAR序列的载体能提高介导的转基因表达水平平均提高10.4倍,5′端含MAR序列的载体表达水平平均提高3.9倍,3′端含MAR序列的载体反而降低转基因表达水平.5′端含MAR序列的表达载体其转基因相对拷贝数高于其它两组载体的基因拷贝数,转基因表达量与基因拷贝数不成正比.     

MAR结合蛋白及其调控功能

核基质结合区 （MAR)是真核生物中能与核基质结合的DNA片段.MAR通过与特异的MAR结合蛋白相互作用,在提高转基因表达水平、降低转基因个体之间表达水平差异以及染色体包装等方面具有重要的调控作用.目前,已在不同物种分离MAR结合蛋白,分别为核基质成分、核仁蛋白、组蛋白、叶绿体蛋白等,它们在调控基因表达、细胞发育、细胞凋亡、染色体包装等方面具有重要的功能.本文综述了目前分离出的MAR结合蛋白及其功能,并对MAR-结合蛋白研究作一展望.