用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV

为从临床样品中检测和分析SARSCoV病毒打基础,并为分析SARSCoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片,探针长度为70nt,每相邻的探针序列重复25nt,共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARSCoV病毒总RNA、7个SARSCoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTPcy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARSCoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布,并且有多处连续的阳性信号点;用正常人的白细胞RNA为对照,杂交未出现明显阳性信号。检测7个SARSCoV病毒基因克隆片段,在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。     

SARS病毒与其他冠状病毒的基因组比较

本文利用生物信息学方法比较SARS病毒和其他冠状病毒基因组.通过数据库搜索,找出与SARS病毒基因组相似的核酸或蛋白质序列,并对相似序列进行比对,分析它们的共性和差异.结果表明,SARS病毒在基因组的组织上及结构蛋白质方面与现有冠状病毒有比较大的相似性,SARS病毒基因组与冠状病毒基因组相关.但是,SARS病毒基因组还存在一些特异性序列,ORF1a和S蛋白(特别是S1)的变化以及SARS-CoV特异性的非结构蛋白可能是SARS发病机理与传染特性区别于其他冠状病毒的分子基础.在全基因组水平上进行核酸单词出现频率分析,结果表明,SARS病毒远离已知的其他冠状病毒,单独成为一类.     

SARS病毒免疫学性状的结构基础分析

运用生物信息学技术,对SARS冠状病毒基因组及其编码区进行了全序列分析,根据其基因和推导蛋白结构特点及同源性分析,探索SARS病毒主要结构蛋白免疫学性状的结构基础及进一步进行免疫学研究的线索,为深入SARS病毒的诊断预防工作提供参考 。     

SARS-CoV Sars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体.采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a-EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白.此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断.用特异性引物扩增出CCVDXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1.用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZ αAS1.将pPICZαAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右.用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达18-116,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因在大肠杆菌的克隆和表达

A novel α-amylase gene was amplified from Sulfolobus shibatae by using PCR technique.The amplified 1.7kb DNA fragment was inserted into an expression vector pBV220 to yield the recombinant plasmid pSBAM. The novel α-amylase gene in pSBAM was expressed in E. coli. The production of the novel α-amylase activity reached over 8 units/100mL of the culture. The molecular weight of this enzyme was about 61kD by SDS-PAGE. The expressed novel α-amylase protein in E.coli DHSα accounted for about 20 % of the total protein in the recombinant cell. The cooperative action of the novel α-amylase and the maltooligosyltrehalose synthase from Sulfolobus shibatae was investigated and trehalose was detected by using HPLC analysis when using amylose and partial starch hydrolysates as substrates.     

新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析

采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研...     

基于生物信息学分析SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2受体结合机制

[目的]预测并分析ACE2受体与SARS-CoV-2S蛋白结合的机制.[方法]从NCBI数据库中获取S蛋白及ACE2蛋白的氨基酸序列,利用在线软件分析其理化性质、高级结构及功能域,通过STRING软件构建ACE2蛋白相互作用网络,分析其关联通路和代谢途径.[结果]S蛋白由1 273个氨基酸组成,与SARS-COVS蛋白...     

人冠状病毒OC43感染性克隆的构建

摘要 目的：构建携带绿色荧光报告基因的人冠状病毒OC43感染性克隆。方法：设计带有绿色荧光蛋白的人冠状病毒OC43感染性克隆基因组序列,分段合成后利用融合聚合酶链式反应等方法得到8个亚基因组片段,通过酵母转化关联重组技术获得重组质粒,转染HEK-293T细胞进行病毒拯救,收获转染细胞培养上清感染靶细胞分析病毒拯救情况。结果：获得人冠状病毒OC43感染性克隆重组质粒,将该质粒转染细胞后成功获得携带绿色荧光蛋白报告基因的人冠状病毒OC43重组病毒。结论：成功构建了人冠状病毒OC43感染性克隆并获得重组病毒,为针对冠状病毒的基础和应用研究提供了有效工具。     

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)概述

2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的新型肺炎.SARS-CoV-2具有高传染性、高致病性以及高死亡率的特...